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1、蛋白表達(dá)純化實驗步驟（待改進(jìn)）1、取適當(dāng)相應(yīng)蛋白高表達(dá)的動物組織提t(yī)otal-RNA。2、設(shè)計蛋白表達(dá)引物。引物要去除信號肽，要加上適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)和保護(hù)堿基。3、RT-PCR，KOD酶擴(kuò)增獲取目的基因cDNA.4、雙酶切，將cDNA.克隆入PET28/32等表達(dá)載體。5、轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)菌中擴(kuò)增，提質(zhì)粒。6、將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株，挑菌檢測并保種。表達(dá)菌株如Bl21（DE3）、Rosettagami（DE3）、Bl21codon（DE3）等。7、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。1）將表達(dá)菌株在3mlLB培養(yǎng)基中搖至OD=0.6左右，加入IPTG，濃度梯度從25μM到1mM。37度誘導(dǎo)
2、過夜(一般3h以上即有大量表達(dá))。2）SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達(dá)。注：目的蛋白包涵體表達(dá)量一般會達(dá)到菌體蛋白的50%以上，在膠上可以看到明顯的粗大的條帶。3）將有表達(dá)的菌株10%甘油保種，保存1ml左右就足夠了，并記錄IPTG濃度范圍。甘油是用0.22μm過濾除菌的，儲存濃度一般是30%-60%，使用時自己計算用量。4）用上述IPTG濃度范圍的最低值誘導(dǎo)10ml表達(dá)菌，18度，低轉(zhuǎn)速（140-180rpm），誘導(dǎo)過夜作為包涵體檢測樣品。注意：1.如果表達(dá)的蛋白對菌體有毒性，可以在加IPTG之前的培養(yǎng)基中加入1%的葡萄糖用來抑制本底表達(dá)。葡萄糖會隨著細(xì)菌的繁殖消
3、耗殆盡，不會影響后面的表達(dá)。2.保種可以取一部分分成50μl一管，每次用一管，避免反復(fù)凍融。8、包涵體檢測。方案見附件29、如有上清表達(dá)，則擴(kuò)大搖菌。1）取保種的表達(dá)菌株先搖10ml，37度，300rpm搖至OD>=1.5，約5h左右，視菌種的活性而異，也可過夜搖菌。2）將上一步中的8ml加入300ml培養(yǎng)基中37度，250rpm搖至OD=1.0左右（約2.5h~3h），然后加IPTG（濃度同包涵體檢測中使用的濃度。）注：菌液濃度要適當(dāng)?shù)臐庖恍?，否則第二天收集不到足夠的菌體，因為低溫低轉(zhuǎn)速細(xì)菌生長非常緩慢。拿起錐形瓶對光搖動，看到有大量云霧狀菌體即可。另一方法是，將手指放
4、在瓶底晃動，看不清手指為宜，不過此法宜受氣泡影響。3）過夜搖菌，使用包涵體檢測的溫度（18°左右），轉(zhuǎn)速140rpm左右。4）將菌液6000rpm，4min，4度離心收集菌體。加入20mMPBS，洗一遍后用平衡緩沖液重懸。每250ml菌液用30ml到50ml平衡緩沖液，視菌液的濃度而定。可用4支50ml的離心管同時離心，但是，離心管要重復(fù)使用，用完后洗凈保存。10、超聲波裂解。1）用6mm變幅桿，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。注意：1.要冰浴。2.要隨時觀察裂解情況以防意外。3.要將探頭探入到溶液中下部，盡量不要打出大量氣泡。一般溶液量比較大的時候不
5、會出現(xiàn)大量氣泡。4.正常聲音為：孜孜聲，尖銳刺耳的聲音表明探頭位置不對或者功率太大或者探頭松動等原因，要及時調(diào)整。溶液由渾濁變清透，由粘稠變不粘稠表明裂解完成（后面3000轉(zhuǎn)離心時，如果沉淀少說明裂解的好）。5.超聲波破碎儀工作30分min要休息5min（即關(guān)閉總電源開關(guān)）。注意：1.如果純化的蛋白較易被蛋白酶降解，在超聲裂解之前要加蛋白酶抑制劑（PMSF），PMSF工作濃度為1%。2.如不能判斷是否裂解完全，就按上述條件裂解60分鐘，60分鐘足夠裂解。1、取得上清1）將破碎好的溶液收集到50ml離心管中。10000rpm，15min，4°離心。沉淀為包涵體、細(xì)胞碎片和未
6、破碎的細(xì)胞。輕輕的將上清倒出，盡量不要倒出沉淀。（此時可以測量一下pH值，pH值最好在7.5左右。平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后上清就會在7.5左右。）2、純化上清---摸洗脫條件。1）鎳柱處理。將1ml鎳柱吸入空層析管中，待其中的液體流完后加入平衡緩沖液3ml。2）將10ml上清加到已經(jīng)平衡過的NI柱上，并將過柱的樣品重復(fù)上樣3次。（若是流速慢可以在柱子下面加一個針頭，或者用1ml的槍將膠體吹散。）取20μl過柱后的樣品，以備跑膠。3）分別加20mM、40mM、60mM、80mM的咪唑梯度來洗脫雜蛋白。每個梯度分別的上樣量為4ml、2ml、2ml、2ml。每
7、個次上樣的液體分前面1ml和后面1ml分別收集入EP管中，以備跑膠。注意：理論上是要將收集的溶液測量280nm處的吸光度，直到吸光度為零時再進(jìn)行下一個梯度的洗脫。實際上測不到零，怎么都會有一點(diǎn)的，上面說的量已經(jīng)做夠洗脫了。4）加ElutionBuffer將目的蛋白洗脫。上樣量為4.5ml（將前面的0.5ml單獨(dú)接入EP管，再將后面的4ml接入另外兩個EP管），留跑膠樣品。5）加MES將NI柱重生。MES加10ml，流完后再加10mlMiliqH2O。流完后保存于2倍體積的20%乙醇中，鎳柱至少能重復(fù)利用6次。（尿素可能對NI柱
