抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)課件.ppt

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1、第四章抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)徐元宏紙片擴(kuò)散法微量液體稀釋法E-TEST法常用方法:原理:將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂平板上,紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周?chē)鷶U(kuò)散形成遞減的梯度濃度,在紙片周?chē)志鷿舛确秶鷥?nèi)測(cè)試菌的生長(zhǎng)被抑制,從而形成無(wú)菌生長(zhǎng)的透明圈即為抑菌圈。抑菌圈的大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度,并與該藥對(duì)測(cè)試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)。紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer法)操作方法:1.將在約56℃恒溫的無(wú)菌M-H瓊脂傾注直徑為90mm的平板,其厚度4mm。2.無(wú)菌挑取孵育16~24h的

2、血平板上4~5個(gè)菌落。3.置于無(wú)菌生理鹽水中,校正其濁度于McFarlandNo0.5管。4.用無(wú)菌棉簽浸入細(xì)菌懸液中,將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過(guò)多的菌液。棉簽在三個(gè)方向均勻抹瓊脂表面(每次轉(zhuǎn)60℃)使菌液均勻分布,最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。5.蓋上平板的蓋子,放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育,放置3~10分鐘后貼上標(biāo)準(zhǔn)抗生素紙片。6.根據(jù)選擇的菌株挑選相應(yīng)的抗菌紙片。腸桿菌科:氨芐西林、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、亞胺培南、氨曲南、慶大霉素;銅綠假單胞菌:頭孢他啶、慶大霉素、哌拉西林、阿米卡星、環(huán)丙沙星、頭孢

3、吡肟、亞胺培南;葡萄球菌屬:頭孢西丁、青霉素、紅霉素、萬(wàn)古霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、利福平;腸球菌屬:青霉素、萬(wàn)古霉素、甲氧芐啶/磺胺異噁唑、慶大霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、氨芐西林不動(dòng)桿菌屬:頭孢他啶、亞胺培南、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、米諾環(huán)素;洋蔥伯克霍德菌:頭孢他啶、米諾環(huán)素、甲氧芐啶/磺胺異噁唑、美羅培南;嗜麥芽窄食單胞菌:甲氧芐啶/磺胺異噁唑、左氧氟沙星、米諾環(huán)素;嗜血桿菌屬:氨芐西林、甲氧芐啶/磺胺異噁唑、頭孢他啶、美羅培南、阿奇霉素、環(huán)丙沙星、頭孢克洛;淋病奈瑟菌:頭孢曲松、

4、環(huán)丙沙星、青霉素、大觀霉素、四環(huán)素;肺炎鏈球菌:紅霉素、苯唑西林、甲氧芐啶/磺胺異噁唑、克林霉素、左氧氟沙星、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素;除肺炎鏈球菌外的其他鏈球菌:紅霉素、青霉素、克林霉素、萬(wàn)古霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星。7.用無(wú)菌鑷子或紙片分配器將抗菌紙片粘貼于M-H瓊脂的表面,一旦紙片貼上,不能移動(dòng);各抗菌紙片中心距離應(yīng)大于24mm,紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm。8.經(jīng)過(guò)35℃16~24h孵育。9.取抑菌環(huán)直徑,根據(jù)CLSI(clinicalandlaboratorystandardsinstitute)標(biāo)準(zhǔn),報(bào)告細(xì)菌對(duì)該抗

5、生素敏感(susceptible,S)、耐藥(resistant,R)、中介(intermediate,I)。原理:聚乙烯板內(nèi)含有各種稀釋度的抗菌藥物,實(shí)驗(yàn)時(shí)加入100μl濃度為105CFU/ml的菌液,蓋上蓋板,35℃16~20h觀察結(jié)果。孔底部清晰不出現(xiàn)細(xì)菌沉淀的最低抗菌藥物濃度即為該抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度,通過(guò)CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷其敏感和耐藥。再取0.01ml容量接種環(huán)取肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)的液體接種于血瓊脂平板作次代培養(yǎng),經(jīng)35℃過(guò)夜培養(yǎng)后觀察最低抗菌藥物濃度能殺死99.9%原始種入的細(xì)菌即為該菌的最低殺菌濃度(M

6、BC)。微量液體稀釋法(microdilutiontest)操作方法:1.抗菌藥物的稀釋和融解2.抗菌藥物母液的稀釋3.在微量聚乙烯微板孔中加入各種不同濃度的抗生素100μl,從低濃度往高濃度加樣,不需要更換吸管。4.挑選18~24小時(shí)的菌落置M-H肉湯增菌4~6小時(shí)。5.制備0.5麥?zhǔn)媳葷峁?,然?:200稀釋,使之最終濃度105CFU/ml。6.用微量加樣器接種100μl到96孔中,蓋上蓋板。同時(shí)作陽(yáng)性、陰性對(duì)照。7.手工看濁度或儀器自動(dòng)判讀。按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告細(xì)菌對(duì)某抗菌藥物為敏感、耐藥和中介。原理:E試條是一條

7、5mm×50mm無(wú)孔試劑載體,一面固定有一系列預(yù)先制備的濃度呈連續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)稀釋抗菌藥物,另一面有讀數(shù)和判別的刻度??咕幬锏奶荻瓤筛采w有20個(gè)MIC對(duì)倍稀釋濃度的寬度范圍。將E試條放在細(xì)菌接種過(guò)的瓊脂平板上,經(jīng)孵育過(guò)夜,圍繞試條明顯可見(jiàn)橢圓形抑菌圈,圈的邊緣與試條交點(diǎn)的刻度濃度即為抗菌藥物抑制細(xì)菌的最小抑菌濃度,對(duì)照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷其敏感、耐藥、中介。E-TEST1.挑取16~20h的菌落2.用無(wú)菌生理鹽水制備成0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫鹊木?。操作方法?.用無(wú)菌棉簽浸入細(xì)菌懸液中,將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過(guò)多的菌液。

8、棉簽在三個(gè)方向平均涂抹瓊脂表面(每次轉(zhuǎn)60℃)使菌液均勻分布,最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。4.用鑷子將E-TEST試條的抗菌藥物的一面貼向瓊脂表面,有刻度的一面向外,直徑140mm的平板可放置6條,9mm平板只能放置1~2試條。5.孵育,置平板于35℃孵育16~24h。6.孵育后形成一橢圓形抑菌圈,抑菌圈和試條的相交處的

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