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1、第四章基因組文庫的構(gòu)建基因組(genomiclibrary)即基因文庫(genebank)是含有某種生物體全部基因的隨機(jī)片斷的重組DNA克隆群體。構(gòu)建基因文庫時先提純生物的總DNA，通過機(jī)械剪切或酶切使其成為一定大小的片段，連接到適當(dāng)載體(常為?噬菌體)上，經(jīng)體外包裝轉(zhuǎn)染細(xì)菌，得到一群含不同DNA片段的重組噬菌體顆粒。此即是基因文庫。這群DNA片段含蓋基因組全部基因。cDNA文庫(cDNAlibrary)：克隆的重組cDNA的總和，通常是在細(xì)菌或酵母中。這些克隆代表從某個特定物種或器官的所有mRNA制備得到
2、的cDNA。cDNA分子克隆(cDNAclone)：將cDNA片段裝在載體上轉(zhuǎn)化細(xì)菌,擴(kuò)增出多克隆的過程，最終可建立cDNA文庫。建庫的目的：1.從復(fù)雜的基因組中分離單拷貝的基因；2.是從來源復(fù)雜的總mRNA的cDNA文庫中分離稀有的cDNA克隆。建庫的關(guān)鍵：如何產(chǎn)生足夠數(shù)量的重組DNA建庫應(yīng)注意：1.保證載體DNA和靶DNA均不被外源DNA序列污染；2.盡可能用“電話克隆”。第一節(jié)DNA克隆片段的產(chǎn)生與分離一.基因組DNA的片段化1.用限制酶片段化:用限制酶消化DNA，不經(jīng)凝膠電泳分部離,直接和載體連接的
3、克隆方法叫鳥槍法(shot-ganapproach)存在的問題：①所形成的重組體分子是一群帶有大小不同插入片段的混合群體。以每個載體可插入1～3kbDNA計算，基因庫至少含10～30萬個重組質(zhì)粒。從中篩出目的基因工作量是很大的。②目的基因內(nèi)部可能有一個以上的酶切位點(diǎn)，即一個基因分載在幾個重組質(zhì)粒上，完整篩出更不容易。2.隨機(jī)片段化：超聲波：可產(chǎn)生300bp的短片段。高速攪拌：1500轉(zhuǎn)/分×30分可切平均長度8kb的分子群體。3.雙酶消化單酶消化的產(chǎn)物一般分子較大，選擇時要考慮到載體容量，如?噬菌體插入片段
4、不超過25kb,為此可選用識別4bp的限制酶(切割平均長度為256bp),識別6bp的限制酶切割平均長度4096bp.雙酶切產(chǎn)生的DNA片段平均大小不超過1kb,但如采用雙酶部分消化，產(chǎn)物的分子量可達(dá)10～30kb,它們存在著隨機(jī)序重疊，用蔗糖梯度離心或凝膠電泳可將這些片段群體按大小分開，可得到的分子量大小約為20kb的隨機(jī)DNA片段群體。二.DNA片斷大小的分部如已知含目的基因克隆片段的大小范圍，可在克隆前用蔗糖梯度離心或瓊脂糖凝膠電泳將DNA群體按大小分部分離。三.目的基因克隆片段的富集。四.克隆數(shù)的確
5、定任一DNA序列在文庫中出現(xiàn)的概率：N:該序列需要克隆的總數(shù)；p:待克隆DNA序列在文庫中設(shè)定的出現(xiàn)概率，一般為99％；I：待克隆DNA片段的長度，假定為17kb;G:基因組DNA的總長度，如人類為3×109bp將數(shù)據(jù)代入上式=8.1×105N的含義是克隆大小為17kb的人類DNA時，所構(gòu)建的基因文庫數(shù)必須在8.1×105以上時，才能以99％的概率得到此克隆。五.cDNA文庫一.概況:cDNA文庫是通過反轉(zhuǎn)錄mRNA，并制備雙鏈cDNA(doublestrandedcDNA)來構(gòu)建的。構(gòu)建cDNA文庫的策略
6、是取決于：(1)目的mRNA的相對豐度；(2)篩選方法：除簡單的分子雜交法外還可對表達(dá)產(chǎn)物用各種方法進(jìn)行鑒定。cDNA文庫的優(yōu)點(diǎn)(1)使遺傳物質(zhì)為RNA病毒可建立文庫；(2)因克隆數(shù)比基因組文庫少得多，易于篩選；(3)從分化特異的細(xì)胞的cDNA文庫中可分離到特異表達(dá)的基因。(4)建庫時已排除了其它的RNA，使假陽性率減低。(5)cDNA文庫可在細(xì)菌中表達(dá)，可用多種策略進(jìn)行篩選。但應(yīng)注意：(1)細(xì)胞中不同mRNA的豐度不同，低豐度的mRNA要求很高的克隆數(shù)(要用公式來計算)。(2)有的基因表達(dá)具有嚴(yán)格的時空性
7、，要獲得其mRNA并非易事。用不同發(fā)育階段，或不同組織細(xì)胞中的mRNA制備的cDNA文庫會包含一些共同和特異序列。這可用于分離差異表達(dá)的基因。(3)cDNA文庫的DNA無內(nèi)含子、調(diào)節(jié)元件和基因間DNA。不能用于基因結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)的研究。一個基因經(jīng)不同的剪接可產(chǎn)生不同的部分重疊的cDNA克隆。2.制備cDNA文庫分離代表細(xì)胞中主要mRNA(rRNA和tRNA因其豐富和大小的一致性，可以通過分級直接分離)。mRNA的提取可以通過多胸腺嘧啶的柱子分離。然后被反轉(zhuǎn)錄。cDNA第一鏈的合成用oligo(dT)引物，因為長
8、的mRNA沒有被完全反轉(zhuǎn)錄,因此中部可加另一引物。第二鏈cDNA的合成是用自身引物的，一個更有效的方法是在cDNA第一鏈加尾(如多聚胞嘧啶)，然后用oligo(G)為引物起始第二鏈的合成。這樣產(chǎn)生的雙鏈cDNA可以通過加接頭或同聚尾巴插入載體。第二節(jié)構(gòu)建文庫的載體一.λ噬菌體載體基礎(chǔ)：裸露的噬菌體重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或包裝后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。載體篩選：在細(xì)菌菌苔中形成噬菌斑。重組篩選：插入載體—通過可見標(biāo)記的插入失
