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《基因組DNA 文庫的構(gòu)建.ppt》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、Loading基因組DNA文庫的構(gòu)建制作:###主講:###基因組DNA文庫與cDNA文庫cDNA文庫:以mRNA為模板,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化,在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA,與適當?shù)妮d體連接后轉(zhuǎn)化受體菌,每個細菌含有一段cDNA,并能繁殖擴增。cDNA文庫特異地反映某種組織或細胞中,在特定發(fā)育階段表達的蛋白質(zhì)的編碼基因,因此cDNA文庫具有組織或細胞特異性?;蚪MDNA文庫與cDNA文庫基因組DNA文庫:指將某生物的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機械力量切割成一定長度的DNA片段,再與適合的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)
2、的宿主細胞獲得的所有陽性菌落。其實質(zhì)就是采用“化整為零”策略,將龐大的基因分解成一段段,每段包含一個或幾個基因。為什么要構(gòu)建基因組DNA文庫對于高等真核生物,基因數(shù)量龐大且復雜,單個目的基因所占比例極其微小,難以直接分離。為增加成功分離的可能性,需要將這個基因進行擴增,但由于分離的是未知基因,故無法進行特異性擴增,只能構(gòu)建該生物材料的基因文庫。構(gòu)建基因組DNA文庫的作用分離有用的目的基因:分離特點的基因片段;分析特點基因結(jié)構(gòu);研究基因表達調(diào)控。保存生物的全部基因:全基因組物理圖譜的構(gòu)建;全基因組序列測定。
3、基因組DNA文庫的特點代表性文庫中所有克隆所攜帶的DNA片段重新組合起來可以覆蓋整個基因組,即可以從該文庫中分離任何一段DNA。隨機性采用機械切割或酶切法隨機斷裂DNA,保證克隆的隨機性。增加文庫重組克隆的數(shù)目,提高覆蓋基因組的倍數(shù)。Clark和Carbon于1975年提出如下公式:N:代表一個完全基因組文庫所應(yīng)該包含的重組克隆個數(shù)。p:表示所期望的目的基因在文庫中出現(xiàn)的概率。f:表示重組克隆平均插入片段的大小和基因組DNA大小的比值。ln(1-p)ln(1-f)N=————————該公式用于預(yù)測一個完整
4、基因組文庫應(yīng)該包含的克隆數(shù)目。制作基因組DNA文庫的常用載體λ噬菌體:最常用到的載體。廣泛用于細菌、真菌等基因組較小的物種研究??滤官|(zhì)粒:穩(wěn)定性較差,大量復制易缺失。細菌人工染色體(BAC):P1源人工染色體(PAC):酵母人工染色體(YAC):可以插入大片段DNA,主要用于基因組做圖等?;蚪MDNA文庫的制作①工具的準備;②載體的制備;③HMWDNA的提??;④HMWDNA的部分酶切與脈沖電泳分級分離;⑤載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細胞;⑥重組克隆的挑選和保存;注1:高純度大分子量基因組DNA(H
5、ighmolecularweightDNA,HMWDNA)。注2:構(gòu)建噬菌體文庫,連接產(chǎn)物不用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化宿主,而是采用包裝蛋白進行包裝并侵染宿主。注3:以下,以λ噬菌體為例簡述DNA文庫的制作過程(P184)。①工具準備λ噬菌體載體;限制性內(nèi)切酶Sau3A、BamHⅠ;瓊脂糖凝膠(或蔗糖);T4連接酶;注1:Sau3A與BamHⅠ,是一對同尾酶。注2:同尾酶是指切割不同的DNA片段但產(chǎn)生相同的粘性末端的一類限制性內(nèi)切酶。②載體的制備cosLRcosBamHⅠ位點載體DNAcosLRcosBB可用載體
6、DNA片段棄去中間片段③HMWDNA的提?、苊}沖電泳分級分離真核基因組DNA(約3×109bp)Sau3A做局部消化被限制酶切開的DNA片段SS瓊脂糖凝膠電泳純化約20kb片段⑤體外包裝與轉(zhuǎn)化cosLRcosBBSST4連接酶約20kbDN片段體外包裝重組噬菌體侵染大腸桿菌大腸桿菌基因文庫小結(jié)1.DNA文庫與cDNA文庫的區(qū)別2.為什么要構(gòu)建DNA文庫3.基因組DNA文庫的作用4.基因組DNA文庫的特點5.如何制作一個DNA文庫感謝聽講