實(shí)驗(yàn)室常用載體介紹(Gateway技術(shù))課件.ppt

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1、實(shí)驗(yàn)室常用載體介紹載體構(gòu)建的基本原理1.TA克隆(T4連接酶)Promega的T-easy載體（pGEM-TEasy）TAKRAT載體(pMD18-T)2.TOPOTA克隆(pCR8/GW/TOPO)定向克隆(pENTR)3.酶切連接實(shí)驗(yàn)室常用4.Gateway技術(shù)TOPO異構(gòu)酶Gateway?技術(shù)基于清楚了解的λ噬菌體位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)(attB+attP；attL+attR)。BP反應(yīng)是DNA片段或者包含attB位點(diǎn)的表達(dá)克隆與包含attP位點(diǎn)的供載體（donorvector）之間進(jìn)行的反應(yīng)。BP反應(yīng)產(chǎn)生入門克隆。LR反應(yīng)是含attL位點(diǎn)的入門克隆和包含attR位點(diǎn)的目的載體之間的重組反應(yīng)

2、。LR反應(yīng)產(chǎn)生表達(dá)克隆。表達(dá)克隆包含目的基因和目的載體特異的啟動子或者一些元件。Gateway?技術(shù)1.創(chuàng)建入門克隆，通過PCR或傳統(tǒng)的克隆方法將目的基因克隆進(jìn)入門載體。2.混合包含目的基因的入門克隆和合適的目的載體及Gateway?LRClonase?酶，產(chǎn)生表達(dá)克隆。致死基因：DB3.1GatewayattB引物attB15’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTNN-3’attB25’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTN-3’Prolinerichproteinlikeprotein(PRPL)SenseprimerGGGGACAAGTT

3、TGTACAAAAAAGCAGGCTATGAACATAAGCCCCCTGTCAntisenseprimerGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCATAAGCACTCTCGCTAGT酶切連接載體超表達(dá)pCAMBIA2300S啟動子pBINm-gfp5-ER和pBI121Gateway技術(shù)載體超表達(dá)pGWB401pGWB501pGWB402pGWB502pGWB402ΩpGWB502Ω可能都要做融合蛋白了，與gfp或者h(yuǎn)is標(biāo)簽，這樣以后就可以做WESTERN了。這邊他們的超表達(dá)都是做的融合蛋白，不過要事先確定融合基因放在５‘還是３’，免得影響其功能。如果不確定就兩種同時

4、做。RNAi啟動子啟動子（截短策略）attL1attL2pDONR201+promoter棉花自己的啟動子？？？誘導(dǎo)表達(dá)怎么工作的？我們怎么用？可以用在哪些地方？loxP34bpCREgeneGlucocorticoidGRintronEGFP效率低的問題：連接反應(yīng)效率低？BP、LR反應(yīng)效率低？轉(zhuǎn)化效率低？切記抗生素鄧鋒林負(fù)責(zé)載體的保管譚家福負(fù)責(zé)相關(guān)酶的管理每個人只給劃平板轉(zhuǎn)基因過程中的注意事項(xiàng)大小皿及濾紙不能混用轉(zhuǎn)基因的共培皿及一些搖菌的三角瓶滅完菌再洗轉(zhuǎn)基因所挑的克隆塊，每個克隆塊分化苗的棵數(shù)煙草轉(zhuǎn)基因的假陽性問題（抗生素）擬南芥的轉(zhuǎn)化公共衛(wèi)生：到完皿之后，繼完代之后，配完培養(yǎng)基之后轉(zhuǎn)基

5、因苗移栽