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《《分子克隆常用載體》PPT課件》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、分子克隆常用載體質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯載體酵母細(xì)胞的克隆載體一、質(zhì)粒載體理想的質(zhì)粒載體必須具備的基本條件1、具有復(fù)制起點(diǎn)2、具有抗菌素抗性基因3、具有若干限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)4、具有較小的分子量和較多的拷貝數(shù)重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pSC101質(zhì)粒載體；ColE1質(zhì)粒載體；pBR322質(zhì)粒載體；pUC質(zhì)粒載體；T載體pUCm-T質(zhì)粒圖譜pUCm-T載體序列二、噬菌體載體噬菌體的生命周期（1）溶菌生長(zhǎng)周期噬菌體（烈性噬菌體）（2）溶源生長(zhǎng)周期噬菌體（溫和噬菌體）（1）烈性噬菌體的生活周期（2）溫和噬菌體的生活周期裂解循環(huán)溶源態(tài)重要的噬菌體載體一、λ噬菌體載體（1）插入型載體：
2、有單一酶切點(diǎn),便于外源DNA插入（2）替換型載體，具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間λDNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代λ噬菌體載體是主要用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建，也經(jīng)常用于外源目的基因的克隆。注意：λ噬菌載體作為載體，其重組噬菌體DNA大小只能：36kb~51kb。體外包裝：λ噬菌體載體+尾部蛋白+頭部蛋白頭部基因 （琥珀突變型）尾部基因 （琥珀突變型）轉(zhuǎn)錄復(fù)制蛋白質(zhì)合成組裝尾部所需要的組分“無(wú)頭部”的提取物組裝頭部所需要的組分“無(wú)尾部”的提取物溫育轉(zhuǎn)錄復(fù)制蛋白質(zhì)合成體外包裝的重組DNA比裸露的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的效率高100-10000倍sup-細(xì)菌完整的噬菌
3、體二、M13噬菌體載體M13是絲狀噬菌體，有長(zhǎng)約6500個(gè)核苷酸的閉環(huán)DNA基因組。M13附著在大腸桿菌的F性菌毛上，所以它們只能感染雄性細(xì)菌。不過(guò)M13噬菌體DNA亦可通過(guò)轉(zhuǎn)染作用導(dǎo)入雌性大腸桿菌細(xì)胞。1.M13噬菌體作為載體優(yōu)越性（1）單鏈DNA噬菌體的復(fù)制，是以雙鏈環(huán)形的DNA為媒介的，這種復(fù)制形式的DNA簡(jiǎn)稱RFDNA。（2）不論是RFDNA還是ssDNA，它們都能轉(zhuǎn)染感受態(tài)的大腸桿菌寄主細(xì)胞。（3）單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA的大小制約的，因此不存在包裝限制問(wèn)題。（4）可產(chǎn)生大量純化的含外源片斷的單鏈DNA分子。2.M13載體篩選方法插入→α-多肽
4、→互補(bǔ)于受體細(xì)胞→半乳糖苷酶未插入→α-多肽→互補(bǔ)于受體細(xì)胞→半乳糖苷酶無(wú)色噬菌斑←不分解X-gal(IPTG)藍(lán)色色噬菌斑←分解X-gal(IPTG)3.M13噬菌體載體的優(yōu)點(diǎn)與其它載體相比，M13載體具有兩個(gè)十分有用的優(yōu)點(diǎn)：①這類載體的基因組中有一條飾變的β-半乳糖苷酶基因片段，其中插入了一段具有密集的多克隆位點(diǎn)的序列。②M13載體系列是應(yīng)用基因工程技術(shù)成對(duì)地構(gòu)建的，可以有效地克隆雙鏈DNA分子的每一條鏈。三、柯斯質(zhì)粒載體1.柯斯載體的組成由質(zhì)粒和λ粘性末端“尾巴”兩部分組成。2、Cosmid載體特點(diǎn)：（1）具有λ噬菌體的特性（但因不含λ噬菌體的全部必需基因，因此不
5、能通過(guò)溶菌周期，無(wú)法形成子代噬菌體顆粒）；（2）具有質(zhì)粒的特性（有質(zhì)粒復(fù)制子及抗菌素基因）；（3）具有高容量的克隆能力（本身僅5-7kb,克隆極限可達(dá)45kb左右）；（4）具有與同源序列質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。四、酵母細(xì)胞的克隆載體1、整合型載體（YIP）YIP型載體是由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的DNA片段構(gòu)成的。這類載體在細(xì)菌中復(fù)制、擴(kuò)增，進(jìn)入酵母后可整合表達(dá)。YIP型載體的特點(diǎn)是轉(zhuǎn)化率低(只有1-10轉(zhuǎn)化子/微克DNA)，但轉(zhuǎn)化子遺傳性穩(wěn)定，多用于遺傳分析工作。2、復(fù)制型載體（YRP）YRP型載體是帶有選擇標(biāo)記和復(fù)制子的酵母的DNA片段插入到大腸桿菌質(zhì)粒中構(gòu)成的。因?yàn)樗瑫r(shí)含
6、有大腸桿菌和酵母的自主復(fù)制基因，所以能在兩種細(xì)胞中存在和復(fù)制可以在兩種截然不同的生物細(xì)胞中復(fù)制的載體稱為穿梭載體，穿梭載體在基因工程中廣泛使用。Thanks!
