熒光分光光度計(jì)的原理及應(yīng)用.上課講義.ppt

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1、熒光分光光度計(jì)的原理及應(yīng)用2021/9/21一、分子熒光的產(chǎn)生1.電子激發(fā)態(tài)的多重度單重激發(fā)態(tài)S：電子自旋方向和處于基態(tài)軌道的電子配對(duì)。第一節(jié)熒光分光光度法原理三重激發(fā)態(tài)T：電子自旋方向和處于基態(tài)軌道的電子平行。2021/9/212.分子能級(jí)與躍遷基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí))：吸收特定頻率的輻射。激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級(jí)圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)；磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越延遲熒光傳遞途徑輻射躍遷熒光振動(dòng)弛預(yù)無(wú)輻射躍遷2021/9/21S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能

2、量l2l1l3外轉(zhuǎn)換l?2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫2021/9/21二、激發(fā)光譜與熒光光譜1.熒光的激發(fā)光譜曲線固定測(cè)量波長(zhǎng)(選最大發(fā)射波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與激發(fā)光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線（圖中曲線I）。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大；2021/9/212.熒光光譜固定激發(fā)光波長(zhǎng),化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線(圖中曲線II)。問題：熒光(磷光)的激發(fā)光波長(zhǎng)如何選擇？Stokes位移：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)。2021/9/21三、熒光強(qiáng)度和溶液濃度的關(guān)系1定量依據(jù)熒

3、光強(qiáng)度If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率?：If=?Ia由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-?lc)If=?I0(1-10-?lc)=?I0(1-e-2.3?lc)濃度很低時(shí)，將括號(hào)項(xiàng)近似處理后：If=2.3?I0?lc=Kc（濃度高時(shí)如何？）2021/9/21標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量：配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度；比較法定量：在線性范圍內(nèi)，測(cè)定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度，比較。2定量方法三、熒光強(qiáng)度和溶液濃度的關(guān)系2021/9/21四、熒光、磷光分析方法的特點(diǎn)（1）靈敏

4、度高比紫外-可見分光光度法高2～4個(gè)數(shù)量級(jí)；為什么？分光光度法所檢測(cè)的是兩個(gè)較大的信號(hào)的微小差別，熒光光度法檢測(cè)的是很小背景值上的熒光強(qiáng)度。（2）選擇性強(qiáng)既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；（3）試樣量少（4）可提供比較多的物理參數(shù)缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍小。2021/9/21第二節(jié)熒光分光光度計(jì)的組成測(cè)量熒光的儀器主要由四個(gè)部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測(cè)器。特殊點(diǎn)：有兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器成直角。基本流程如圖：?jiǎn)紊鳎哼x擇激發(fā)光波長(zhǎng)的第一單色器和選擇發(fā)射光(測(cè)量)波長(zhǎng)的第二單色器；光源：氙燈?和高壓汞燈，染料激光器檢測(cè)器：

5、光電倍增管。2021/9/21儀器光路圖問題：參考光電管作用？2021/9/21第三節(jié)熒光分析法的應(yīng)用(1)無(wú)機(jī)化合物的分析與有機(jī)試劑配合物后測(cè)量；可測(cè)量約60多種元素。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測(cè)定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測(cè)定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y(cè)定；鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測(cè)定(2)生物與有機(jī)化合物的分析見表2021/9/212021/9/212021/9/21作業(yè)P1432021/9/21