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1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理及應(yīng)用謝建紅實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基本原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR就是通過對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中,引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì),隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì),熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán),收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào),這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖.熒光擴(kuò)增曲線分為三個(gè)階段:熒光背景信號(hào)階段、熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。熒光背景信號(hào)階段:為擴(kuò)增最初的10~
2、15個(gè)循環(huán),擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。平臺(tái)期:擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。指數(shù)期:此期PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,因此我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,引入了兩個(gè)非常重要的概念:熒光閾值和CT值。熒光閾值:是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值,它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上,但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光
3、信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。CT值:每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值。CT值與起始模板的關(guān)系研究表明,每個(gè)模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,到達(dá)熒光閾值的CT值越小,反之越大。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù),橫坐標(biāo)代表Ct值。因此,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。定量方法絕對(duì)定量:是用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,在相同的條件下目的基因測(cè)得的熒光信號(hào)量同標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較,從
4、而得到目的基因的量。相對(duì)定量:是通過與內(nèi)參基因Ct值之間的相差來計(jì)算表達(dá)基因的差異,也稱之為2-ΔΔCt。其他定量方法熒光定量PCR檢測(cè)模式熒光定量PCR的理論基礎(chǔ):均基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的原理,即當(dāng)一個(gè)熒光基團(tuán)與一個(gè)淬滅基團(tuán)的距離鄰近時(shí)(<10nm),就會(huì)發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移,淬滅基團(tuán)會(huì)吸收熒光基團(tuán)在激發(fā)光作用下的激發(fā)熒光,從而使其發(fā)不出熒光。但如果熒光基團(tuán)一旦與淬滅基團(tuán)分開,淬滅作用即消失。檢測(cè)模式SYBRGreenI檢測(cè)模式:SYBRGreenI是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料。與雙鏈DNA結(jié)合后
5、,其熒光大大增強(qiáng)。在PCR反應(yīng)體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,發(fā)射熒光信號(hào),而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào),從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBRGreenI工作原理缺點(diǎn):PCR反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會(huì)產(chǎn)生熒光,通常本底較高,引起假陽性。優(yōu)點(diǎn):通用性好,價(jià)格低,在科研中使用較普遍。水解探針模式(Taqman)TaqMan探針是一種寡核苷酸探針,熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端,而淬滅劑則在3’末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí)
6、,熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí),聚合酶的5’外切酶活性將探針進(jìn)行酶切,使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離,發(fā)射熒光。一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子熒光信號(hào)的產(chǎn)生,隨著循環(huán)數(shù)增加,熒光信號(hào)不斷積累。分子信標(biāo)探針模式分子信標(biāo)是一種在靶DNA不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中,環(huán)一般為15-30個(gè)核苷酸長,并與目標(biāo)序列互補(bǔ);莖一般5-7個(gè)核苷酸長,并相互配對(duì)形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)連接在莖臂的一端,而淬滅劑則連接于另一端。模板不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu),熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)緊
7、緊靠近而被淬滅。當(dāng)存在模板時(shí),環(huán)序列將與模板配對(duì),此時(shí)分子信標(biāo)成鏈狀而非莖環(huán)狀,熒光基團(tuán)與淬滅劑分開,使得熒光基團(tuán)發(fā)出熒光。其它還有雙雜交探針、蝎形探針、LUXPrimers等模式。引物設(shè)計(jì)原則引物最適長度為15~20bp.G+C含量為40~60%。引物的Tm值應(yīng)相似,差異不超過1~2℃.產(chǎn)物長度在80~150bp.不能形成引物二聚體。Taqman探針設(shè)計(jì)原則長度30-45bp,Tm比引物至少高5℃。盡量靠近上游引物。5’端不要有G,G會(huì)有淬滅作用,影響定量。3’端必須封閉。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用目前實(shí)時(shí)熒光PCR
8、技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域。其中最主要的應(yīng)用集中在以下幾個(gè)方面:1.DNA或RNA的絕對(duì)定量分析:包括病原微生物或病毒含量的檢測(cè),轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測(cè),RNAi基因失活率的檢測(cè)等。2.基因表達(dá)差異分析:例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異(如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等),特定基因