乳酸菌的生理生化特性.doc

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1、1.形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,將已純化后的甘油菌種活化后于37℃下培養(yǎng)20～24h,并進(jìn)行革蘭氏染色及菌體形態(tài)和菌落特征的觀察。染色方法參照微生物鑒定實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)2.生長(zhǎng)條件試驗(yàn)(1)耐鹽性試驗(yàn)(NaCl濃度:0.85、1.20和1.71)(mol/L);(2)耐酸堿試驗(yàn)(pH:4.3、5.7、6.8、8.4、8.6和8.7);(3)溫度梯度試驗(yàn)(溫度:10℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃和65℃)。分別將參試菌接種于以上處理的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h,記錄生長(zhǎng)狀況。3.生理生化試驗(yàn)⑴過氧化氫酶測(cè)定將實(shí)驗(yàn)

2、菌接種于PGY培養(yǎng)基斜面上,37℃培養(yǎng)20h—24h,取一環(huán)接種的培養(yǎng)物,涂于干凈的載玻片上,然后在其上滴加3%－—15%的過氧化氫,有氣泡則為陽性反應(yīng),無氣泡為陰性反應(yīng)。⑵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)在PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)加入30g葡萄糖和5%吐溫-80,1.6g/100mL的溴甲酚紫1.4mL作指示劑,在培養(yǎng)基內(nèi)放置一小倒管,分裝試管置37℃培養(yǎng)24h,經(jīng)培養(yǎng)后,指示劑變黃表示產(chǎn)酸,倒管內(nèi)出現(xiàn)氣泡,表示產(chǎn)氣。⑶淀粉水解實(shí)驗(yàn)接種新鮮的菌種于含有0.5g可溶性淀粉的PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,取少許培養(yǎng)液于比色盤內(nèi),同時(shí)取未接種的培養(yǎng)液作對(duì)照,分別

3、在其中加入盧哥氏碘液.不顯色表示淀粉水解,顯藍(lán)黑色或藍(lán)紫色時(shí),表示淀粉未水解或水解不完全。⑷明膠液化實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)菌接種于明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,置37℃培養(yǎng),以一支未接種的試管作為對(duì)照。將接種的和未接種的對(duì)照管置于冰箱或冷水中,等待對(duì)照管凝固后記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果,反復(fù)觀察對(duì)比多次。如對(duì)照管凝固時(shí),接種管液化為陽性反應(yīng),凝固為陰性反應(yīng)⑸甲基紅（M.R）試驗(yàn)接種實(shí)驗(yàn)細(xì)菌于PYG培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)2天后，于培養(yǎng)物中加入幾滴甲基紅酒精溶液，如呈紅色，表示陽性。⑹乙酰甲基甲醇V-P實(shí)驗(yàn)接種新鮮的實(shí)驗(yàn)菌種于培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)2天后,取培養(yǎng)液1mL

4、在其中加入1ml10％的NaOH，混勻，再加入3－4滴2%氯化鐵溶液。數(shù)小時(shí)后，培養(yǎng)基表面的下層出現(xiàn)紅色者，為陽性⑺檸檬酸鹽取幼齡菌種接種于檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基上，適溫培養(yǎng)3－7天，培養(yǎng)基呈堿性（藍(lán)色）者為陽性反應(yīng)，不變者則為陰性⑻酪素水解試驗(yàn)牛奶平板的制備：取5g脫脂奶粉加入50mL蒸餾水中（或用50mL脫脂牛奶），另稱1.5g瓊脂溶于50mL蒸餾水中，將兩液分開滅菌。待冷至45－50℃時(shí)，將兩液混勻倒平板，即成牛奶平板。將平板倒置過夜，使表面水分干燥，然后將菌種點(diǎn)接在平板上，每皿可點(diǎn)接3－5株菌。適溫培養(yǎng)1、3、5天，記錄

5、菌落周圍和下面酪素是否已被分解而呈透明。配制該培養(yǎng)基時(shí)，切勿將牛奶和瓊脂混合滅菌，以防牛奶凝固⑼厭氧生長(zhǎng)測(cè)定將菌種接入營(yíng)養(yǎng)肉湯平板后,用密封帶包好放入CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)2天后,觀察生長(zhǎng)情況,生長(zhǎng)則為陽性(10)厭氧硝酸鹽產(chǎn)氣接種封油：以斜面菌種用接種環(huán)接種后，用凡士林油（凡士林和液體石蠟為1:1）封管，封油的高度約1厘米。必須同時(shí)接種不含有硝酸鉀的肉汁胨培養(yǎng)液作對(duì)照。觀察結(jié)果：培養(yǎng)2－7d，觀察在含有硝酸鉀的培養(yǎng)基中有否生長(zhǎng)和產(chǎn)生氣泡。如有氣泡產(chǎn)生，表示反硝化作用產(chǎn)生氮?dú)?，為陽性反?yīng)。但如不含硝酸鉀的對(duì)照培養(yǎng)基也可產(chǎn)生氣

6、泡，則只能按可疑或陰性處理。(11)石蕊牛奶的反應(yīng)牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑。石蕊在中性時(shí)呈淡紫色，酸性時(shí)呈粉紅色，堿性呈藍(lán)色，還原時(shí)則自上而下地褪色變白。觀察其產(chǎn)酸、產(chǎn)堿、胨化、酸凝固、凝乳酶凝固、還原情況(12)糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)將需要測(cè)定的糖或醇類等碳水化合物加入PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,按表分裝含5mL培養(yǎng)基的試管.分別取0.2mL,被鑒定菌株接到滅菌后的碳水化合物培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24h,振蕩培養(yǎng)。檢測(cè)時(shí)取培養(yǎng)液少許置于比色盤內(nèi),同時(shí)取未加碳水化合物的PY培養(yǎng)液作為對(duì)照,滴加試劑比

7、較顏色的變化,記錄產(chǎn)酸的強(qiáng)弱.附一些培養(yǎng)基：①PY培養(yǎng)基（100mL）：蛋白胨1.0g,酵母提取物1.0g,無機(jī)鹽溶液4.0mL[鹽溶液成分:無水CaCl20.2g,MgSO420.0g,K2HPO41.0g,,KH2PO41.0g,NaHCO310.0g,NaCl2.0g](將CaCl2和MgSO4一起溶解于300mL蒸餾水中,再加500mL蒸餾水,一邊攪拌一邊緩慢加入其他鹽類.繼續(xù)攪拌直到全部溶解,加蒸餾水定容至1000mL,混合后貯備于4℃)②PYG培養(yǎng)基:PY在基礎(chǔ)培養(yǎng)液內(nèi)加入1.0g葡萄糖③營(yíng)養(yǎng)明膠蛋白胨5g、牛肉

8、膏3g、明膠120g、蒸餾水1000mL、pH6.8～7.0；加熱溶解、校正至pH7.4～7.6，分裝小管，121℃高壓滅菌10min，取出后迅速冷卻，使其凝固。復(fù)查最終pH應(yīng)為6.8～7.0④檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基：檸檬酸鈉3gNH4H2PO41gMgSO40.2gK2HPO41gNaCl5