乳酸菌的生理生化特性(2)1.doc

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1、1材料和方法1.1樣品來源四川成都菊樂酸奶（AD）,盈棚小米椒(B)，紅原酸奶（CEF）1.2培養(yǎng)基1.2.1MRS培養(yǎng)基蛋白胨10.0g酵母膏5.0g牛肉膏10.0g葡萄糖20.0g檸檬酸二銨2.0g無水乙酸鈉5.0gTween801.0mlMgSO4·7H2O0.2gMnSO4·H2O0.05g瓊脂15g蒸餾水1000ml注：pH=6.2~6.4，115°C滅菌30min。1.2.2PY培養(yǎng)基蛋白胨10.0g酵母膏10.0g鹽溶液40.0ml蒸餾水1000ml注：調(diào)pH至7.0～7.2，121

2、℃滅菌15min。鹽溶液：無水CaCl20.2gMgSO4·7H2O0.48gK2HPO41.0gNaCl2.0gKH2PO41.0gNaHCO310.0g蒸餾水1000mL4℃?zhèn)溆谩?.2.3PYG培養(yǎng)基蛋白胨10.0g酵母膏10.0g鹽溶液40.0ml葡萄糖10.0g蒸餾水1000ml注：調(diào)pH至7.0～7.2，121℃滅菌15min。1.2.4明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基蛋白胨1.0g牛肉膏1.0g明膠12.0g葡萄糖0.1g鹽溶液4.0ml蒸餾水1000mL115℃高壓滅菌30min。1.2.5產(chǎn)葡聚糖

3、試驗(yàn)培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0g酵母提取物5.0g檸檬酸三銨5.0g磷酸氫二鉀5.0g葡萄糖50.0g瓊脂15.0g115℃滅菌30min。1.2.6溶性淀粉培養(yǎng)基向PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入0.5％的可溶性淀粉。1.2.7氨酸水解試驗(yàn)培養(yǎng)基蛋白胨5.0g肉浸膏5.0g葡萄糖0.5gL-精氨酸10.0g吡多醛5.0mg蒸餾水1000mL1.6g/100ml溴甲酚紫乙醇溶液0.625g甲酚紅液2.5mlpH6．0～6．5，3ml／管分裝，121℃滅菌15min。1.2.8石蕊牛奶培養(yǎng)基脫脂奶粉100g，25

4、g/L石蕊40ml蒸餾水1000ml115℃滅菌30min1.2.9檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基檸檬酸鈉3.0gNH4H2PO41.0gMgSO40.2gK2HPO41.0gNaCl5.0g瓊脂15.0g蒸餾水1000ml調(diào)PH至7，加入1.6%溴麝香草酚藍(lán)指示劑10ml，培養(yǎng)基呈綠色，分裝試管，每管5ml，121℃30min。1.2.10含硝酸鉀的營養(yǎng)肉湯加入2g硝酸鉀入營養(yǎng)肉湯。1.3主要試劑與溶液(1)過氧化氫，溴甲酚紫，可溶性淀粉，盧戈氏碘液，甲基紅酒精溶液，(2)脫脂奶粉，硝酸鉀，凡士林，石蕊，(

5、3)溴甲酚紫指示劑：1.6g溴甲酚紫，蒸餾水100ml。盧哥氏碘液：碘1.0g，碘化鉀2.0g，蒸餾水300ml。精氨酸液：L-精氨酸1.5g，lg/10ml蒸餾水的半胱氨酸溶液0.05ml，蒸餾水10ml，調(diào)pH7.0，滅菌后備用。奈氏試劑：A液(氫氧化鉀20g，蒸餾水50m1)與B液(碘化鉀5g，碘化汞10g，蒸餾水50m1)混合后過濾，貯存于暗色瓶?jī)?nèi)備用。BTB-MR試劑：BTB0.2g，MR0.1g，95％乙醇300ml，蒸餾水200ml。1.4試驗(yàn)器材載玻片，蓋玻片，倒管，試管，培養(yǎng)皿，

6、比色盤。2試驗(yàn)方法2.1形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，將已純化后的甘油菌種活化后于37℃下培養(yǎng)20～24h，并進(jìn)行革蘭氏染色及菌體形態(tài)和菌落特征的觀察。染色方法參照微生物鑒定實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)2.2生長(zhǎng)條件試驗(yàn)(1)耐鹽性試驗(yàn)(NaCl濃度:0.85、1.20和1.71)(mol/L);(2)耐酸堿試驗(yàn)(pH:4.3、5.7、6.8、8.4、8.6和8.7);分別將參試菌接種于以上處理的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h,記錄生長(zhǎng)狀況。2.3生理生化試驗(yàn)⑴過氧化氫酶測(cè)定將實(shí)驗(yàn)菌接種于PGY培養(yǎng)基斜面上,37

7、℃培養(yǎng)20h—24h,取一環(huán)接種的培養(yǎng)物,涂于干凈的載玻片上,然后在其上滴加3%－—15%的過氧化氫,有氣泡則為陽性反應(yīng),無氣泡為陰性反應(yīng)。⑵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)在PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)加入30g葡萄糖和5%吐溫-80,1.6g/100mL的溴甲酚紫1.4mL作指示劑,在培養(yǎng)基內(nèi)放置一小倒管,分裝試管置37℃培養(yǎng)24h,經(jīng)培養(yǎng)后,指示劑變黃表示產(chǎn)酸,倒管內(nèi)出現(xiàn)氣泡,表示產(chǎn)氣。⑶淀粉水解實(shí)驗(yàn)接種新鮮的菌種于含有0.5g可溶性淀粉的PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,取少許培養(yǎng)液于比色盤內(nèi),同時(shí)取未接種的培養(yǎng)液作對(duì)照,分別在其

8、中加入盧哥氏碘液.不顯色表示淀粉水解,顯藍(lán)黑色或藍(lán)紫色時(shí),表示淀粉未水解或水解不完全。⑷明膠液化實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)菌接種于明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,置37℃培養(yǎng),以一支未接種的試管作為對(duì)照。將接種的和未接種的對(duì)照管置于冰箱或冷水中,等待對(duì)照管凝固后記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果,反復(fù)觀察對(duì)比多次。如對(duì)照管凝固時(shí),接種管液化為陽性反應(yīng),凝固為陰性反應(yīng)⑸甲基紅（M.R）試驗(yàn)接種實(shí)驗(yàn)細(xì)菌于PYG培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)2天后，于培養(yǎng)物中加入幾滴甲基紅酒精溶液，如呈紅色，表示陽性。⑹乙酰甲基甲醇V-P實(shí)驗(yàn)接種新鮮的實(shí)驗(yàn)菌種于P