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1、DNA凝膠電泳DNAagarosegelelectrophoresis實(shí)驗(yàn)七瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對(duì)分子量成反比。不同構(gòu)型的DNA分子的遷移速度不同。如環(huán)形DNA分子樣品，其中有三種構(gòu)型的分子：共價(jià)閉合環(huán)
2、狀的超螺旋分子（cccDNA）、開環(huán)分子(ocDNA)、和線形DNA分子(IDNA)。這三種不同構(gòu)型分子進(jìn)行電泳時(shí)的遷移速度大小順序?yàn)?cccDNA＞IDNA＞ocDNA當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色，在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外，還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶，用于以后的克隆操作。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)材料：PCR產(chǎn)物,植物基因組DNA,質(zhì)粒DNA等，購(gòu)買或自行提取純化。實(shí)驗(yàn)試劑：5×TBE電泳緩沖液：6×電泳載樣緩沖液
3、：0.25％溴粉藍(lán)，40％(w/v)蔗糖水溶液，貯存于4℃。溴化乙錠(EB)溶液母液：將EB配制成10mg/mL，用鋁箔或黑紙包裹容器,儲(chǔ)于室溫即可。實(shí)驗(yàn)材料和試劑微波爐實(shí)驗(yàn)儀器凝膠電泳槽凝膠成像系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)步驟取5×TBE緩沖液20mL加水至200mL，配制成0.5×TBE稀釋緩沖液，待用。膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖，置于200mL錐形瓶中，加入50mL0.5×TBE稀釋緩沖液，放入微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為0.8％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時(shí)搖動(dòng)，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽
4、兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5μg/mL。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。加樣：取10μLDNA樣品與2μL6×上樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏
5、低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個(gè)樣品要更換tip頭，以防止互相污染，注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋，立即接通電源。控制電壓保持在60-80V，電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí)，停止電泳。染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/mL的EB溶液中，室溫下染色20-25min。觀察和拍照：在波長(zhǎng)為254nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。瓊脂糖
6、主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)中，在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽(yáng)極遷移，其遷移速率由下列多種因素決定：1、DNA的分子大小2、瓊脂糖濃度3、DNA分子的構(gòu)象4、電源電壓5、嵌入染料的存在6、離子強(qiáng)度影響DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性，配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套，并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗。沾染了EB的垃圾要專門處理后才可丟棄。當(dāng)EB太多,膠染色過深，DNA帶看不清時(shí)，可將膠放入蒸餾水沖泡，30
7、min后再觀察。制備凝膠時(shí)，倒膠的溫度不可太低，否則凝固不均勻：速度也不可太快，否則容易出現(xiàn)氣泡。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素的影響？思考題
