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1、HPLC流動(dòng)相的緩沖液緩沖液流動(dòng)相可以根據(jù)下面的操作步驟配制：將緩沖液藥品溶解在水中制成緩沖液（溶液A）。用pH計(jì)確定或調(diào)節(jié)溶液A的pH。將一定體積（如200ml）的有機(jī)溶劑B與由步驟2配制的溶液A（如800ml）混合，制成最終流動(dòng)相（此處的有機(jī)相為20%）。檢查最終流動(dòng)相的pH（此處為選項(xiàng)）。由于測(cè)定含有有機(jī)調(diào)節(jié)劑的流動(dòng)相pH計(jì)發(fā)生漂移，使其測(cè)定pH不很可靠，所以上面的步驟4一般只有在考察誤差的主要來源時(shí)采用，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室皆略去此步驟。步驟1一般是將配制緩沖液所用的兩種試劑（A1和A2）分別按計(jì)算量先溶解在水中制成水溶液，然后再將這兩種溶液按一定的比例混合得到預(yù)期
2、pH的溶液A。若在此步驟2中調(diào)節(jié)pH，則可以采用溶劑A滴定溶劑B，也可反過來滴定，并通過pH計(jì)測(cè)量得到所需pH的最終緩沖溶液。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中，pH的測(cè)量精度通常不會(huì)達(dá)到±0.05—0.1個(gè)pH單位，這會(huì)顯著影響一些樣品的分離。當(dāng)HPLC方法對(duì)pH非常敏感時(shí)，步驟2只能大致確定pH值。????將準(zhǔn)確稱重的緩沖液配制試劑與精確體積的脫氣蒸餾水混合，使其成為均一的溶液（不進(jìn)一步調(diào)整pH），如此配得得緩沖溶液得pH可以控制在非常窄得范圍內(nèi)（±0.02單位），已知準(zhǔn)確pH值得緩沖液濃溶液已有市售。????為了改善峰形或塔板數(shù)，有時(shí)在流動(dòng)相中加入酸或堿（如三乙胺、乙酸等），如
3、果這些添加劑并非為配制緩沖溶液時(shí)所采用得試劑，那么將這些試劑加入到流動(dòng)相中后，還需重新滴加酸或堿，使流動(dòng)相達(dá)到所需的pH值。常用緩沖液的配制????當(dāng)緩沖液被稀釋或濃縮時(shí)，pH也應(yīng)不變。其pH值應(yīng)近似恒定不變，或當(dāng)其中的離解的陽(yáng)離子（K+、Na+）或陰離子（Cl-、Br-）被其它種類的離子替換時(shí)，表1—4中給出了響應(yīng)的配制方法，平衡陽(yáng)離子為Na+，緩沖液的最終濃度為0.1mol/l，對(duì)于其它濃度的緩沖溶液或陽(yáng)離子種類（通常K+）更好，表中的數(shù)據(jù)也可供參考。較稀的或較濃的緩沖溶液，及包含有不同陽(yáng)離子的溶液，其pH值會(huì)與表中的數(shù)據(jù)稍有出入。在方法建立過程中，精確的流動(dòng)相
4、pH值往往并不重要，重要的是每次新配制的流動(dòng)相的pH值與第一次基本相同（最好控制在±0.02范圍內(nèi)）。注意，只有當(dāng)緩沖溶液的pH在緩沖試劑解離常數(shù)pKIa±1范圍內(nèi)時(shí)，緩沖溶液才具有有效的緩沖容量（如乙酸鹽的pKa=4.6，其適宜的pH范圍為3.6—5.6）。表1低pH值（25℃）磷酸鹽緩沖溶液的配制方法溶液A1：0.1M磷酸。配制精確pH值緩沖液時(shí)，所用磷酸需滴定H3PO4的含量。溶液A2：0.1M磷酸二氫鈉溶液，稱量13.8gNaH2PO4·H2O溶解于水中，定容于1L容量瓶中。????pH????A1體積（ml）????A2體積（ml）????????pH??
5、??A1體積（ml）????A2體積（ml）????2.0????565????435????????2.8????175????825????2.2????455????545????????3.0????110????890????2.4????345????655????????3.2????55????945????2.6????250????750????????????????????表2不同pH值（25℃）醋酸緩沖溶液的配制方法溶液A1：0.1M醋酸溶液。6.0g（5.8ml）冰醋酸溶于水中，定容到1L容量瓶中。溶液A2：0.1M醋酸鈉溶液。8.2gC
6、2H3O2Na（或13.6gC2H3O2Na·3H2O）溶解于水中定容到1L容量瓶中。????pH????A1體積（ml）????A2體積（ml）????pH????A1體積（ml）????A2體積（ml）????3.6????926????74????4.8????400????600????3.8????880????120????5.0????296????704????4.0????820????180????5.2????210????790????4.2????736????264????5.4????176????824????4.4????610??
7、??390????5.6????96????904????4.6????510????490????????????????表3不同pH值（25℃）檸檬酸緩沖溶液的配制方法溶液A1：0.1M檸檬酸溶液。21.0g檸檬酸溶于水中，定容到1L容量瓶中。溶液A2：0.1M檸檬酸鈉溶液。29.4gC6H5O7Na3·2H2O溶解于水中，定容到1L容量瓶中。????pH????A1體積（ml）????A2體積（ml）????pH????A1體積（ml）????A2體積（ml）????3.0????930????70????5.2????360????660????3.2?
