雙酶切連接反應(yīng)的注意要點(diǎn).doc

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1、雙酶切連接反應(yīng)的注意要點(diǎn)雙酶切:1、在雙酶切載體時(shí)如果2個(gè)酶切位點(diǎn)靠得很近,必須注意酶切順序。因?yàn)橛械南拗菩詢(xún)?nèi)切酶要求其識(shí)別序列的兩端至少保留有若干個(gè)堿基才能保證酶的有效切割。有的酶要求識(shí)別序列兩端有多個(gè)堿基的,則必須先切,否則就可能造成酶切失敗。2、回收PCR產(chǎn)物:回收的PCR產(chǎn)物片段=1:10 ,一般取前者0.03pmol,后者取0.3pmol。pmol為單位的DNA轉(zhuǎn)換為為?g單位的DNA:(Xpmoles×長(zhǎng)度bp×650)/1,000,000(注:長(zhǎng)度bp×650是該雙鏈DNA的分子量)所得數(shù)值即為?g,也可以直接用這個(gè)公式套.1pmol1000bp

2、DNA=0.66μg,如載體是5380bp,則0.03pmol為0.03×5.38×0.66=0.?g。3、雙酶切時(shí)間及其體系:需要強(qiáng)調(diào)的是很多人建議酶切過(guò)夜,其實(shí)完全沒(méi)有必要,一般酶切3個(gè)小時(shí),對(duì)于PCR產(chǎn)物,可以過(guò)夜酶切,效果會(huì)很好。酶切體系不宜過(guò)大,會(huì)影響質(zhì)粒和酶的碰撞機(jī)會(huì),效果降低;質(zhì)粒量不應(yīng)該超過(guò)酶切要求的最大量,否則酶切不完全,酶的用量控制在1U酶在15-20ul體系中酶解1ugDNA。4、兩種酶切的條件不同時(shí),分別進(jìn)行兩次酶切,切完一個(gè)純化后再切:溫度要求不同,先酶切低溫要求的,再酶切高溫要求的;若鹽濃度要求不同,先酶切低鹽濃度要求的,再酶切高鹽

3、濃度要求的。5、若質(zhì)粒是在TE中保存的,TE中的EDTA可能與酶的激活因子螯合,影響酶切效果,可放大酶切體積或重新濃縮質(zhì)粒。6、限制酶的選擇非常重要,盡量選擇粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶,提前看好各公司的雙切酶所用公用的BUFFER,以及各酶在公用BUFFER里的效率。選好酶切位點(diǎn)后,在各個(gè)酶的兩邊加上保護(hù)堿基。7、純化問(wèn)題:純化PCR產(chǎn)物割膠還是柱式,推薦柱式,因?yàn)楦钅z手法不準(zhǔn),很容易割下大塊的膠,影響純化效率?,F(xiàn)在的柱式純化號(hào)稱(chēng)可以祛除引物,既然如此,酶切掉的幾個(gè)堿基肯定也會(huì)被純化掉了。所以,PCR產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物的純化均可應(yīng)用柱式純化。8、酶量的問(wèn)題

4、:以TAKARA的為例,其對(duì)1單位酶的定義如下:在50μl反應(yīng)液中,30℃溫度下反應(yīng)1小時(shí),將1μg的λDNA完全分解的酶量定義為1個(gè)活性單位(U)。而該酶濃度約為15單位/微升,在除外酶降解的因素外,該酶可分解15μg的DNA,而一般從1-4ml菌液提出的DNA約為3μg,而PCR純化后的產(chǎn)物(50體系)約為3μg,所以即便全部加進(jìn)去,只要純化的質(zhì)量好,酶切完全切得動(dòng)。9、酶切、回收后的PCR產(chǎn)物與載體的連接:摩爾比的計(jì)算,很多人憑經(jīng)驗(yàn)也可以。但對(duì)于初學(xué)者從頭認(rèn)真計(jì)算則非常有必要。回收的載體片段:回收的PCR產(chǎn)物片段=1:10 ,一般取前者0.03pmol,

5、后者取0.3pmol。pmol為單位的DNA轉(zhuǎn)換為為?g單位的DNA:(Xpmoles×長(zhǎng)度bp×650)/1,000,000(注:長(zhǎng)度bp×650是該雙鏈DNA的分子量)所得數(shù)值即為?g,也可以直接用這個(gè)公式套.1pmol1000bpDNA=0.66μg,如載體是5380bp,則0.03pmol為0.03×5.38×0.66=0.?g。測(cè)DNA濃度可以在專(zhuān)用機(jī)子上測(cè),注意OD值,一般約1.8-2.0.另外,如果嫌麻煩,也可用MARKER進(jìn)行估測(cè),如MARKER2000,5微升的MARKER每個(gè)條帶約50ng。10、連接反應(yīng):TAKARA的連接酶上的說(shuō)明寫(xiě)的過(guò)

6、夜,而其對(duì)連接酶單位的定義為:在20μl的連接反應(yīng)體系中,6μg的λDNA-HindIII的分解物在16℃下反應(yīng)30分鐘時(shí),有90%以上的DNA片段被連接所需要的酶量定義為1個(gè)活性單位(U)。而它的濃度為350U/μl,所以完全夠用。連接酶容易失活,注意低溫操作,最好在冰上。時(shí)間3個(gè)小時(shí)足已。11、雙酶切時(shí)如果兩種酶反應(yīng)溫度一致而buffer不同時(shí),可查閱內(nèi)切酶供應(yīng)商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer中的活力表,如果有一種buffer能同時(shí)使2種酶的活力都超過(guò)70%的話,就可以用這種buffer作為反應(yīng)buffer;如果兩種酶廠家不同無(wú)法查時(shí)可比較

7、其buffer成份,相似的話可以考慮各取一半中和;任何時(shí)候2種酶的總量不能超過(guò)反應(yīng)體系的1/10體積,而且最大反應(yīng)體系最好不要小于20ul。如果2種酶的buffer成份相差較大或2種酶的反應(yīng)溫度不同則必須分別做酶切。第1種酶切后要考慮用酚抽、電泳后膠回收或加熱等方法使酶失活后再進(jìn)行下一次酶切反應(yīng)。廠家目錄一般都會(huì)有相應(yīng)的附錄以供查閱各種酶的反應(yīng)溫度。有的酶可以用加熱使之失活,如CIAP;有的則不行。12、第一次酶切后通過(guò)電泳確證酶切完全后可以從膠中回收DNA片段再進(jìn)行下次酶切,也可以在第一個(gè)酶切后直接用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化酶切樣保留少量樣品做電泳分析之用,

8、再進(jìn)行下一次酶切。還可以用一種離心純化

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