滴度檢測方法.doc

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1、名稱原理特點優(yōu)缺點P24核心蛋白定量法ELISAKit物理（顆粒）滴度經(jīng)典方法，簡單、重復(fù)性好RNA基因組定量法RT-qPCR物理（核酸）滴度精度高，但對儀器和操作要求高GFP熒光技術(shù)法FACS（流式細(xì)胞計數(shù)）感染滴度經(jīng)典方法，簡單、重復(fù)性好抗性克隆技術(shù)法細(xì)胞克隆計數(shù)感染滴度克隆形成需約2周Dot-blot法RNAdot-blot物理（核酸）滴度簡單，但屬于半定量DNA定量法感染細(xì)胞后定量載體DNA感染滴度最接近真實感染滴度，但不同細(xì)胞感染效率不同慢病毒滴度檢測方法空斑測定法空斑法測定滴度的主要原理是病毒感染QBI-293A細(xì)胞后，通過一個感染周期便可再感染鄰近細(xì)胞，直至

2、形成一個成熟的空斑。這是所有生物學(xué)方法測定病毒滴度中最具挑戰(zhàn)性的方法。由于許多因素如單層細(xì)胞質(zhì)量、操作和觀察方法等都可影響到最后的結(jié)果，因此這一方法得到的結(jié)果往往最不穩(wěn)定。1．5×105細(xì)胞/60mm培養(yǎng)皿用5mlDMEM5%培養(yǎng)，3-4小時后等細(xì)胞貼壁即可進(jìn)行病毒感染?；蛘咴诓《靖腥厩耙惶旒尤?×105細(xì)胞/60mm培養(yǎng)皿。2．在12孔板中稀釋病毒，儲存于-20℃或-80℃?zhèn)溆谩５?個稀釋孔將病毒保存液稀釋至1ml，其它孔稀釋至3ml，大體積可提高可重復(fù)性。稀釋濃度原則視病毒濃度而定（純化還是未純化的），調(diào)節(jié)稀釋度至10-100個病毒/孔，一般為10-12，這樣稀釋比大

3、約為10-7~10-12。稀釋：將100ul病毒保存液加入900ulDMEM5%。用移液器上下吸打5次，此時稀釋度為10-1。換用新槍頭將300ul10-1稀釋液加入2.7mlDMEM5%吸打5次，稀釋度為10-2。然后分別取300ul前一稀釋液加入2.7mlDMEM5%，形成一系列稀釋度，最后4個稀釋度用于感染細(xì)胞。注意：每次稀釋時都必須換用新槍頭。3．吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，每個培養(yǎng)皿中加入1ml病毒稀釋液和1mlDMEM5%，十字形輕輕晃動混勻，37℃培養(yǎng)90分鐘。4．吸去培養(yǎng)液，按5.2.2中所述加入1.25%瓊脂糖培養(yǎng)基。5．37℃培養(yǎng),經(jīng)常注意是否有空斑形成和是否需要

4、加入新鮮培養(yǎng)基。21天后應(yīng)該可以看到空斑形成的白色小斑點。結(jié)果:計數(shù)有多少個獨立的空斑形成，將此數(shù)目乘以稀釋度即可得到每毫升產(chǎn)生的空斑形成單位(PFU/ml)。50%組織培養(yǎng)感染劑量法此方法基于最高稀釋度下在QBI-293A細(xì)胞中CPE的形成，它是昆騰公司用于測定滴度的標(biāo)準(zhǔn)方法。細(xì)胞準(zhǔn)備：1．收集一瓶QBI-293A細(xì)胞，計數(shù)。2．用DMEM2%準(zhǔn)備20ml105/ml細(xì)胞。3．用12道排槍在2塊96孔板中每孔加入100ul細(xì)胞懸液。5.8.3.2準(zhǔn)備稀釋病毒液1．第1管中加入0.9mlDMEM2%，其余加入1.8ml。第1管中再加入0.1ml病毒保存液。2．上下吸打5次

5、混勻。3．換用新槍頭。4．從第1管中吸取0.2ml加入第2管中。5．反復(fù)稀釋至最高稀釋度。6．用同一管病毒保存液進(jìn)行第2輪稀釋。7．最后8個稀釋液加入96孔板，每孔0.1ml，每個稀釋度10孔，2孔為陰性對照。陰性對照孔中加入0.1mlDMEM2%監(jiān)測細(xì)胞存活情況。加樣時從最高稀釋度開始。8．37℃培養(yǎng)10天。9．10天后倒置顯微鏡下觀察，計算每一排中出現(xiàn)CPE的孔數(shù)。只要有一小點或是一些細(xì)胞出現(xiàn)CPE即為陽性，如果無法確定，可與陰性對照比較。10．計算每一排中出現(xiàn)陽性的孔數(shù)。如果陰性對照中無任何CPE且細(xì)胞生長良好，最低稀釋度100%陽性而最高稀釋度100%陰性，則本測

6、試即為有效。