熒光定量PCR服務.doc

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1、熒光定量PCR技術服務流程一.引物和探針的設計1.公司專利的Beacon技術（針對microRNA的檢測）。a.將mRNA序列轉換成DNA序列。取3’末端5～6個堿基的區(qū)域，使之退火溫度達到16℃（按照A、T=2℃;C、G=4℃的原則計算）。并用oligo6寫出mRNA的反向互補序列。（方法：將序列粘貼至oligo6，用“Change”選項中的“Strands”。）b.正向引物的設計：先根據(jù)mRNA的部分序列設計正向引物，長度為15個堿基左右序列與mRNA一致，5’端與mRNA的5’端起始堿基一致，使當前引物退火溫度達到40～42℃，在引物的5’末

2、端添加堿基，最終使引物退火溫度達到56℃左右，計算原則同上。引物總長盡量短。注意：檢查正向引物自身形成的二聚體。3’端互補不超過3個堿基。c.Beacon探針的設計：將mRNA反向互補序列的16℃部分連同后面的2～3個堿基（注意：這2～3個堿基與正向引物的重疊不超過三個堿基。）復制下來，然后在此序列前后部分別添加相應的互補序列，作為“莖環(huán)結構”中的“莖”部分，此結構必須嚴格配對，目前通用序列為CGCAGG和CCTGCG，可供參考。在序列和前半部分的莖序列之間應添加若干堿基，使Beacon探針的退火溫度達到60℃左右。當然也可在此序列后部和后半半部分

3、的莖序列之間添加，但要注意和正向引物的重疊。注意：用oligo6軟件不時的檢查莖環(huán)結構是否存在，以及此探針和已設計完的正向引物之間的二聚體情況。d.莖環(huán)結構逆轉錄引物的設計：用Beacon探針的前部莖環(huán)節(jié)構序列參與“莖”的部分，即GGCCCTG和GCCAGCG。然后在反向引物和探針序列之間添加2～3個堿基，長度在40個堿基左右。目前通用序列為：GGCCCTGACATCAGATGTGTTGGCTATACG＋探針除了后半部分“莖”序列的部分，可供參考。注意：需檢查所設計引物的結構情況。e.反向引物的設計：在上述莖環(huán)節(jié)構逆轉錄引物前端取20個堿基左右的序

4、列，作為反向引物的序列，退火溫度在54~56℃。例如：CATCAGATGTGTTGGCTA，可供參考。注意：設計完成之后，檢查其自身互補、與正向引物和Beacon探針的互補情況。1.普通引物的設計（針對待檢基因）a.搜索基因相關信息根據(jù)客戶所提供的基因編號，在NCBI上查出該基因的相關信息，以文本的形式先保存下來。b.運用oligo6設計相應的引物在上述從NCBI上摘錄的信息中找到該基因的編碼區(qū)位置，即“CDS”這一部分的序列，將其復制下來，打開oligo6把復制的序列粘貼上去，并“Accept”。點擊“Change”菜單選中第一項“Current

5、OligoLength”，設定其長度為20個堿基。然后選擇“Search”選項的第一項“ForPrimersandProbes”，在彈出的對話框中選中“SearchRanges”，把PCR產(chǎn)物的大小設為100～150個堿基，最后點擊“OK”開始搜索。c.選擇適當?shù)囊镆话銘x擇該序列中后部的引物，盡量靠近后部，再用“Analyze”選項里的“DuplexFormation”分析正向引物之間、反向引物之間以及正反向引物之間的二聚體形成情況，引物3’末端互補的堿基不超過3個。二.客戶樣品組織或細胞樣品a.收到樣品后立即置于-80℃冰箱冷凍保存。等到用時

6、再取出，操作時盡量縮短樣品暴露在室溫狀態(tài)下的時間。b.TotalRNA抽提：往離心管中加入500ulEzol，勻漿（如樣品為細胞，則不需勻漿，直接加1mlEzol至離心管中）。稱取適量的組織樣品（一般為10～20mg左右，細胞樣品則不需要稱重。）于2ml離心管中。勻漿后補加500ulEzol，將離心管上下顛倒混勻，室溫放置10min。加入200ulRNA專用的三氯甲烷，上下顛倒混勻，直至離心管中的液體徹底混勻，成乳白色狀。室溫放置5min，12000rpm/min離心15min。小心將上清轉移至另一干凈的1.5ml離心管中，切勿吸動中層蛋白相和下層

7、有機相。往上清中加入500ul預冷的RNA專用的異丙醇，室溫放置5min。10000rpm/min離心10min。小心棄盡上清，加入1mlRNA專用的75％的乙醇洗滌沉淀，10000rpm/min離心10min。小心棄盡上清，置于室溫晾干乙醇，加入適量的DEPC水溶解，混勻。注意：上述步驟中所用離心管均經(jīng)DEPC水處理。試劑均為RNA專用試劑。抽提人員需帶上手套和口罩。用移液器吸上清時槍頭切勿觸碰RNA沉淀所在的一側管壁。c.RNA電泳：將按上述步驟抽提的totalRNA取適量的體積進行1％瓊脂糖凝膠電泳。分析結果，評價抽提質量。注意：完整的tot

8、alRNA應包含清晰的28s，18s和5s三條帶形，28s與18s的總量比應為2：1。RNA樣品收到樣品后立即置于-80℃