小室遷移實(shí)驗(yàn).doc

《小室遷移實(shí)驗(yàn).doc》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、小室遷移實(shí)驗(yàn)[精華提要]小室遷移實(shí)驗(yàn)已被廣泛用于研究不同類型包括轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力。該實(shí)驗(yàn)對檢驗(yàn)趨化因子或細(xì)胞趨化抑制劑的化合物是有用的。檢測依賴于透水層的支持，通常這是組織培養(yǎng)處理的微孔濾膜，它位于兩個(gè)小室之間，模仿兩個(gè)不同的微環(huán)境對細(xì)胞生存/生長。細(xì)胞在膜的一側(cè)，從小室的另一側(cè)感應(yīng)的趨化因子，可以通過微孔膜遷移。被移植的細(xì)胞可以用簡單的固定/染色的計(jì)數(shù)方法量化。人類乳腺上皮腺癌MD-231細(xì)胞生長比較快，是轉(zhuǎn)移性的。以下就以MB-231細(xì)胞細(xì)胞株為例描述細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的基本程序。材料，試劑和

2、設(shè)備1.人類的MDA-MB-231細(xì)胞（ATCC＃HTB-26）2.Dulbecco的改良Eagle培養(yǎng)基，DMEM（Invitrogen公司＃10313-021）3.胎牛血清（ATCC＃30-2020）4.胰蛋白酶/EDTA（Invitrogen公司＃25200-056）5.胰蛋白酶抑制劑，大豆（Invitrogen公司＃17075-029）6.PBS（Invitrogen公司＃14190-144）7.I型膠原（Sigma-Aldrich公司＃C7661）或纖維連接蛋白（BD公司＃）8.Corni

3、ng?Transwell?聚碳酸酯膜嵌入物（Sigma-Aldrich公司＃CLS3421），或Millicell小細(xì)胞培養(yǎng)嵌入物（Millipore公司＃PI8P01250）9.戊二醛（Sigma-Aldrich公司＃G6257）10.乙醇（Sigma-Aldrich公司＃）11.結(jié)晶紫（Sigma-Aldrich公司C3886）12.棉簽13.細(xì)胞培養(yǎng)孵化器：37°C和5％CO2。TCC制定Leibovitz的L-15中型，ATCC＃30-2008程序1.MB-231細(xì)胞裝入含10％胎牛血清的D

4、MEM（如果需要的話使用L–15介質(zhì)）。2.洗兩次，用1xPBS和胰酶消化細(xì)胞。3.將0.5mg/ml的胰蛋白酶抑制劑的PBS加入到等量的滅活胰蛋白酶。吸細(xì)胞輕輕吹打向上和向下，重要的是盡可能分解成單個(gè)細(xì)胞。4.輕輕吹打掉細(xì)胞。用含0.5％FBS的DMEM洗滌細(xì)胞2次，以去除微量胰蛋白酶和抑制劑。重懸于0.5％FBS的DMEM并計(jì)數(shù)的細(xì)胞。5.要準(zhǔn)備的Transwell小室，24孔的格式，8微米的插入孔徑：1)在下格添加0.5％FBS的DMEM2.6毫升（含有40微克/毫升膠原蛋白I）2)裝入Tra

5、nswell聚碳酸酯膜嵌入物。6.注意：確保無氣泡在膜和介質(zhì)之間。7.從第4步開始，在上層室，輕輕地添加1×105細(xì)胞。8.在Transwell小板中以37°C，5％，CO22.5小時(shí)孵育的細(xì)胞。這使得細(xì)胞通過過濾膜遷移到過濾器的底部。9.2.5小時(shí)后，輕輕地去除嵌入膜，沒有遷移的細(xì)胞因此留在濾膜上側(cè)，并小心用棉簽去除。盡可能完全的凈化過濾器。10.過濾器的下側(cè)細(xì)胞迅速由5％戊二醛固定10分鐘11.過濾器的下側(cè)的細(xì)胞用含有1％結(jié)晶紫的2％的乙醇染色20分鐘。12.快速在ddH2O洗去多余的結(jié)晶紫。用

6、棉簽插入兩側(cè)排出多余的水分。干燥插入膜。13.統(tǒng)計(jì)顯微鏡觀察到的過濾器的下側(cè)細(xì)胞數(shù)量。隨機(jī)選擇不同的視野，并計(jì)算平均數(shù)。14.應(yīng)進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)程序，對照組無趨化因子。每個(gè)遷移條件應(yīng)做重復(fù)測試。