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1、動(dòng)物基因工程（AnimalGeneticEngineering）第十一章第一節(jié)基因工程概述基因工程：是應(yīng)用DNA重組技術(shù)，把供體細(xì)胞中的基因或基因組提取出來(lái)，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，經(jīng)過(guò)體外加工重組，或者把人工合成的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并獲得新的遺傳特性的技術(shù)?；蚬こ痰暮诵募夹g(shù)是DNA的重組技術(shù)，還包括基因的表達(dá)技術(shù)、基因的突變技術(shù)、基因的導(dǎo)入技術(shù)等。目的基因的獲取；用工具酶對(duì)目的基因和載體進(jìn)行加工處理，把目的基因與載體結(jié)合成重組DNA分子；把重組的DNA分子引入受體細(xì)胞，并使目的基因和載體上其他基因得
2、以表達(dá)；轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的擴(kuò)增、鑒定與篩選?；蚬こ痰幕静僮鞒绦蛞弧⑾拗菩詢?nèi)切酶第二節(jié)基因操作中的工具酶(一)限制內(nèi)切酶的概念限制性內(nèi)切酶：簡(jiǎn)稱限制酶，是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。(二)限制性內(nèi)切酶的命名屬名＋種名＋菌株類型＋限制性酶種類(三)限制性內(nèi)切酶分類(四)Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的基本特征在DNA分子雙鏈的特異性識(shí)別序列部位切割，使DNA雙鏈斷裂。識(shí)別序列一般為4、5、6個(gè)堿基對(duì)。切割方式有兩種：平頭末端和粘性末端。常用限制性核酸內(nèi)切酶的特性微生物名
3、稱酶名稱識(shí)別順序產(chǎn)生的末端類型BacillusamyloliquefaciensH解淀粉芽孢桿菌BamHⅠGGATCCCCTAGG5’突出Bacilliusglobigil球芽孢桿菌BglⅡACATCTTCTACA平頭末端EscherichiacoliRY13大腸桿菌EcoRⅠGAATTCCTTAAG5’突出Haemophilusinfluenzae流感嗜血菌HindⅢAAGCTTTTCGAA5’突出Providenciastuartii164普羅威登細(xì)菌PstⅠCTGCAGGACGTC3’突出Str
4、eptomycesalbusSubspeciespathocidicus白色鏈球菌SalⅠGTCGACCAGCTG5’突出(五)Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的主要用途1、重組DNA分子2、繪制物理圖譜二、DNA聚合酶三、DNA連接酶(DNAligase)DNA連接酶可以催化帶有粘性末端或平頭末端的雙鏈DNA中一條鏈的3'－OH與另一條鏈的5'－PO3H2形成磷酸二酯鍵而相連，從而構(gòu)成一條完整的DNA長(zhǎng)鏈。(1)兩個(gè)雙鏈DNA片段連接起來(lái)5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊT4DNA連接酶5ˊ-ACGAATTCGT-3
5、ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ(2)修補(bǔ)帶有缺口的雙鏈DNA分子T4DNA連接酶重要的工具酶工具酶活性限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNAT4DNA連接酶催化DNA5ˊ-磷酸與3ˊ-羥基形成磷酸二酯鍵DNA聚合酶以DNA為模板合成DNA逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成DNA堿性磷酸酶切除末端磷酸T4多聚核苷酸激酶催化核酸5'-羥基磷酸化末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化3'-端合成同聚體尾第三節(jié)基因克隆常用的載體載體(vector)：是把外源基因(目的基因)片斷引入受體細(xì)胞，并
6、在其中能自我復(fù)制的小型DNA分子。載體具備的基本特點(diǎn)：①在宿主細(xì)胞中能獨(dú)立自主地復(fù)制；②表達(dá)載體含有強(qiáng)啟動(dòng)子，能驅(qū)動(dòng)靶基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)；③容易從宿主細(xì)胞中分離純化；④載體DNA基因組中有一段不影響它們復(fù)制的非必需區(qū)域，插在其中的靶片段能被動(dòng)地跟著載體DNA一起復(fù)制，就像載體的正常成分一樣。載體的種類(按用途)1、克隆載體：以繁殖DNA片段為目的的載體。2、穿梭載體：既能在真核細(xì)胞又能在原核細(xì)胞繁殖的載體。3、表達(dá)載體：用來(lái)將克隆的外源基因在寄主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)成蛋白質(zhì)的載體。一、質(zhì)粒(plasmid)1
7、、質(zhì)粒的概念：是細(xì)菌細(xì)胞染色體外存在于細(xì)胞質(zhì)中能進(jìn)行自我復(fù)制的一類小型DNA分子，大部分為雙鏈環(huán)狀。(一)質(zhì)粒的一般性質(zhì)2、質(zhì)粒大?。合嗖詈艽?從小于1Kb到大于500Kb)，都有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。5、質(zhì)粒的宿主范圍：窄宿主范圍質(zhì)粒(只能在一種特定的宿主細(xì)胞中復(fù)制)和廣宿主范圍質(zhì)粒(復(fù)制起始點(diǎn)不特異，可以在許多細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制)。3、質(zhì)粒的拷貝數(shù)：高拷貝質(zhì)?？梢杂?0～100個(gè)拷貝，低拷貝只有1～4個(gè)拷貝。4、質(zhì)粒的不親和性：也稱不相容性，兩種或兩種以上親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能夠在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地共存
8、。(二)質(zhì)粒的類型嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒——每個(gè)細(xì)胞中有1～2個(gè)拷貝，具有自身傳遞能力，分子量大。松弛型質(zhì)?！總€(gè)細(xì)胞中有10～100個(gè)拷貝，不具有自身傳遞能力，分子量小?；蚬こ坛Ｓ么祟愘|(zhì)粒。常用的質(zhì)粒有：pBR322、Psc101、ColE1、Psc134等。質(zhì)粒載體一般能克隆10Kb左右的DNA片段。(三)理想質(zhì)粒載體的基本要求能夠在宿主細(xì)胞中大量自我復(fù)制，以便得到大量的重組DNA分子。具有一種或多種限制酶的單一切割位點(diǎn)，并在此位點(diǎn)插入外源DNA片段。分子量
