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1、D高等哺乳動物的基因轉(zhuǎn)移第十二章動物基因工程C高等哺乳動物的載體系統(tǒng)B高等哺乳動物的受體系統(tǒng)A高等哺乳動物基因工程的基本概念A(yù)高等哺乳動物基因工程的基本概念高等哺乳動物基因工程高等哺乳動物細胞基因表達技術(shù)高等哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因動物個體動物工程細胞哺乳動物遺傳性狀改良藥物篩選研究評價模型人體基因治療蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)藥物篩選研究評價模型B高等哺乳動物的受體系統(tǒng)高等哺乳動物細胞的生長特性高等哺乳動物受體細胞的條件高等哺乳動物受體細胞的遺傳標(biāo)記常用的高等哺乳動物受體細胞高等哺乳動物細胞的生長特性正常的哺乳類動物細胞具有
2、下列四大生物學(xué)特征：錨地依賴性：細胞必須附在固體上或固定的表面才能生長分裂血清依賴性：細胞必須具有生長因子才能生長接觸抑制性：細胞與細胞接觸后，生長便受到抑制形態(tài)依賴性：細胞稱扁平狀，并有長纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上述特征使得正常的哺乳動物細胞在體外培養(yǎng)中，一般只能存活50代且在培養(yǎng)皿上以平面的形式生長，即單層細胞生長。有時，正常細胞會改變某些特征而越過生理臨界點，繼續(xù)增殖并無限制分裂，這種狀態(tài)稱為細胞系形成，此時的細胞成為細胞系。高等哺乳動物受體細胞的條件以高效表達外源基因為目標(biāo)的高等哺乳動物受體細胞應(yīng)具備下列條件細胞系特征喪失細胞
3、接觸抑制性和錨地依賴性特征，便于大遺傳穩(wěn)定性外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長期保存合適的標(biāo)記便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持生長快且齊分裂周期短，生長均一，便于控制規(guī)模培養(yǎng)大多數(shù)正常的高等哺乳動物細胞并不能同時具備上述條件，癌細胞能安全性能好不合成分泌致病物質(zhì)，不致癌滿足上述前四項要求，但在安全性能上有欠缺。高等哺乳動物受體細胞的遺傳標(biāo)記營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細胞5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）次黃嘌呤核苷一磷酸（HMP）次黃嘌呤核苷（HR）GMPAMP尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）胸腺嘧啶核苷（T
4、R）嘌呤核苷酸生物合成途徑嘧啶核苷酸生物合成途徑次黃嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPRT）（TK）胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤（AP）氨基喋呤（AP）從頭合成途徑補救合成途徑氨基喋呤（AP）高等哺乳動物受體細胞的遺傳標(biāo)記營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細胞含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）編碼基因缺陷的受體細胞（tk-）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因tk能與之遺傳互補含有次黃嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPRT）編碼基因缺陷的受體細胞（hprt-）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基
5、上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因hprt與之遺傳互補高等哺乳動物受體細胞的遺傳標(biāo)記哺乳動物受體細胞常見的遺傳選擇標(biāo)記常用的高等哺乳動物受體細胞迄今為止，用于醫(yī)療用品（藥物、抗體、診斷試劑）大規(guī)模生產(chǎn)的高等哺乳動物受體細胞主要還是中國倉鼠卵巢細胞（CHO），其優(yōu)勢有如下幾個方面：遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定與人的親緣關(guān)系接近，外源蛋白修飾準(zhǔn)確基因轉(zhuǎn)移和載體表達系統(tǒng)完善耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)被美國FDA確認為安全的基因工程受體細胞（GRAS）C高等哺乳動物的載體系統(tǒng)猴多瘤病毒SV40人牛痘病毒DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA桿
6、狀病毒DNA猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由VP1、VP2、VP3三種衣殼蛋白包裝而成，基因組為5224bp的雙鏈環(huán)狀DNASV40的生物學(xué)特性SV40可以與所有哺乳動物宿主細胞中的組蛋白H2、H3、H4結(jié)合，從而使其DNA形成類似核小體的微型染色體結(jié)構(gòu)。SV40感染猴細胞時呈裂解型，不致癌；但感染嚙齒類動物后，便發(fā)生非同源整合而致癌。猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40的基因組DNAt/T基因編碼病毒的小抗原和大SV40DNAoriVP2TVP3VP1t抗原與病毒的致癌作
7、用密切相關(guān)SV40在裂解宿主細胞前的晚期狀態(tài)時，每個宿主細胞含有105個病毒DNA拷貝，因此十分適合用于高效表達外源蛋白猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40DNA-質(zhì)粒DNA雜合載體的構(gòu)建重組的SV40DNA分子必須經(jīng)過包裝后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大。為了盡量提高SV40的裝載量，必須刪除一些基因片段，因此重組的SV40分子必須與野生型病毒共感染受體細胞，才能形成有感染力的重組病毒顆粒。AproriviralgenegptSV40oripV2-GPTpBR322pBR322SV40pV2-GPT是一
8、種SV40DNA與大腸桿菌質(zhì)粒DNA雜合的載體，其中g(shù)pt為細菌來源的谷丙轉(zhuǎn)氨酶基因，用于篩選重組子。猴多瘤病毒DNA（SV40）利用SV40DNA載體表達外源基因的程序SV40載體病毒晚期基因啟動子篩選標(biāo)記ori缺陷的SV40輔助病毒去除細菌序列插入外源基因重組分子分離病毒DNA轉(zhuǎn)化篩選增殖感染猴多瘤
