rna提取方法及其比較

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1、Trizol法1)將新鮮葉片約100mg放入液氮預冷過的1.5ml的Eppendorf管中,用帶有200ul槍頭的加樣槍迅速將材料搗碎成粉末(搗碎過程中Eppendorf管部分浸在液氮中),然后加入1mlTrizol試劑。振蕩,充分混勻后,冰浴靜置15min。2)加入200ul預冷的氯仿,振蕩混勻,冰浴靜置5min。4℃,12000g離心15min。3)吸取上清,加入與上清液成0.6倍體積的高鹽溶液(1.2mol/L氯化鈉和0.8mol/L檸檬酸鈉)輕輕顛倒混勻,再加入與高鹽溶液等體積的異丙醇,輕輕顛倒混

2、勻,-20℃靜置15min。4℃,12000g離心5min。4)棄去上清,加入1ml70%的乙醇洗滌沉淀。4℃,7500g離心5min。5)棄去上清,將沉淀干燥5min,加入40ulDEPC水溶解沉淀。CTAB-LiCl法：取0.2g新鮮組織或-70℃保存的樣品，在液氮中充分研磨成粉末狀，將磨好的粉末迅速轉(zhuǎn)移至65℃預熱的含有600μlCTAB提取液的離心管中，立即渦旋振蕩30s，使其混勻；置65℃水浴中2~5min，期間渦旋振蕩3~5次；稍微冷卻后加入等體積的氯仿/異戊醇渦旋振蕩1min后，4℃，120

3、00r/min離心15min；取上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇渦旋振蕩1min，4℃，12000r/min離心15min；將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，加入1/3體積的8mol/LLiCl，使其終濃度為2mol/L，4℃過夜沉淀；4℃，12000r/min離心20min，棄上清；分別用70%乙醇，無水乙醇洗沉淀，室溫晾干，加30~50μlDEPC-H2O溶解沉淀。CTAB-異丙醇法：步驟同CTAB-LiCl法，用等體積的異丙醇沉淀。CTAB-LiCl及CTAB-異丙醇法都能成功的提取擬南芥及煙草幼嫩種子的

4、總RNA，只有Trizol法沒有提取成功。在Trizol法提取的RNA中，未檢測到28SrRNA和18SrRNA，只檢測到5SrRNA，說明Trizol法不適合提取擬南芥及煙草幼嫩種子的總RNA。在CTAB-LiCl及異丙醇法中，28SrRNA和18SrRNA條帶清晰，28SrRNA的亮度基本為18SrRNA的2倍，表明提取的總RNA很少降解。CTAB-異丙醇法提取的5SrRNA條帶較CTAB-LiCl法明顯。CTAB-異丙醇法提取的RNA電泳檢測時，在點樣孔下方有明顯的亮帶，說明該方法提取的RNA有較多

5、的基因組DNA污染；CTAB-LiCl法所提取的總RNA基本無基因組DNA污染，但是對小分子RNA的沉淀效果不如CTAB-異丙醇。反轉(zhuǎn)錄是檢測RNA質(zhì)量的良好方法，因為多糖等雜質(zhì)的污染將抑制RNA的反轉(zhuǎn)錄，同時RNA的降解也會影響mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA長度，導致后續(xù)試驗失敗。