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1、基因敲除:是通過一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理,用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段,從而達(dá)到基因敲除的目的。隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展,除了同源重組外,新的原理和技術(shù)也逐漸被應(yīng)用,比較成功的有基因的插入突變和iRNA,它們同樣可以達(dá)到基因敲除的目的。RNA干擾是與靶基因同源的雙鏈RNA誘導(dǎo)的特異轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。其作用機(jī)制是雙鏈RNA被特異的核酸酶降解,產(chǎn)生干擾小RNA(siRNA),這些siRNA與同源的靶RNA互補(bǔ)結(jié)合,特異性酶降解靶RNA,從而抑制、下調(diào)基因表達(dá)。已經(jīng)發(fā)展成為基因治療、基因結(jié)構(gòu)功能研究的快速而有效
2、的方法。RNA干擾技術(shù)的原理和應(yīng)用馬鵬鵬薛社普韓代書(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系,北京)RNAi是由雙鏈RNA所引起的序列特異性基因沉默。RNAi首先由Fire等發(fā)現(xiàn)于秀麗隱桿線蟲(C.elegans)中,他們發(fā)現(xiàn)將dsRNA注入線蟲體內(nèi)后可抑制序列同源基因的表達(dá),并證實(shí)這種抑制主要作用于轉(zhuǎn)錄之后,所以又稱RNAi為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)。隨后人們陸續(xù)在果蠅(Drosophila)、錐蟲(Trypanosomes)、渦蟲(Planaria)、斑馬魚(Zebrafi
3、sh)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大小鼠和人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象,遺傳學(xué)研究表明RNAi是真核生物中一種普遍存在且非常保守的機(jī)制,與真核細(xì)胞中許多重要生物學(xué)過程密切相通過對(duì)RNAi現(xiàn)象的遺傳學(xué)與生物化學(xué)研究,其作用機(jī)制已日漸清晰(見圖1)。Zamore等利用果蠅胚胎提取物建立的體外系統(tǒng),證實(shí)RNAi是一個(gè)依賴ATP的過程,在此過程中,dsRNA(外源的或體內(nèi)產(chǎn)生的)首先被降解為具5"2單磷酸、長21~23bp的小分子雙鏈RNA,這種RNA分子稱為小干擾RNA,siRNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別具同源序列的mRNA,并介導(dǎo)其降解。研究表明在生物體中siR
4、NA具相似的結(jié)構(gòu)特征:為長約21~23bp的雙鏈RNA,具5"單磷酸和3"羥基末端,互補(bǔ)雙鏈的3"端均有一個(gè)2~3nt的單鏈突出。在RNAi過程中一種稱為Dicer的核酸酶負(fù)責(zé)將dsRNA轉(zhuǎn)化為siRNA,它屬于RNaseⅢ家族,具有兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域、一個(gè)解旋酶(helicase)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PAZ(Piwi/Argonaute/Zwille)結(jié)構(gòu)域,Dicer在催化過程中以二聚體的形式出現(xiàn),其催化結(jié)構(gòu)域在dsRNA上反平行排列,形成四個(gè)活性位點(diǎn),但只有兩側(cè)的兩個(gè)位點(diǎn)有內(nèi)切核酸酶活性,這兩個(gè)位點(diǎn)在相距約22bp的距離切斷dsRNA,各種生物體內(nèi)Dicer結(jié)構(gòu)略有不同,致使si
5、RNA長度存在微小差別。siRNA形成之后,與一系列特異性蛋白結(jié)合形成siRNA誘導(dǎo)干擾復(fù)合體(siRNAinducedinterferencecomplex,RISC),此復(fù)合物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別靶mRNA并使其降解,從而導(dǎo)致特定基因沉默。在RISC中,起靶序列識(shí)別作用的是siRNA的反義鏈,Zamore等發(fā)現(xiàn)在RNAi過程中,首先產(chǎn)生的是RISC無活性前體,分子量~250kD,當(dāng)加入ATP后可形成100kD的活性復(fù)合體。由無活性前體向活性酶復(fù)合物的轉(zhuǎn)換類似蛋白酶原的激要求結(jié)合于其上的siRNA雙鏈的解開。在ATP存在時(shí),依賴于ATP的解旋酶解開siRNA的雙鏈并將其正
6、義鏈與靶mRNA置換,mRNA取代正義鏈與反義鏈互補(bǔ),然后由活化的RISC在互補(bǔ)區(qū)的中間,距離siRNA反義鏈3"末端約12bp處切斷靶mRNA序列。RNAi效應(yīng)具有兩個(gè)明顯的特征,特異性和高效性。干擾的高效性提示在機(jī)制中存在信號(hào)放大的步驟。Fire等早在1998年便發(fā)現(xiàn)少量的dsRNA就能夠?qū)е戮€蟲大量的靶mRNA降解,但單憑少量dsRNA被Dicer降解為幾十個(gè)siRNA并不能解釋這種高效性。許多研究顯示RNAi過程中有新的dsRNA分子的合成,當(dāng)siRNA反義鏈識(shí)別并結(jié)合靶mRNA后,siRNA反義鏈可作為引物,以靶mRNA為模板在依賴于RNA的RNA聚合酶(RNA2
7、dependentRNApolymerase,RdRP)催化下合成新的dsRNA,然后由Dicer切割產(chǎn)生新的siRNA,新siRNA再去識(shí)別新一組mRNA,又產(chǎn)生新的siRNA,經(jīng)過若干次合成切割循環(huán),沉默信號(hào)就會(huì)不斷放大(圖1)。正是這種稱為靶序列指導(dǎo)的擴(kuò)增(target2directedamplification)機(jī)制賦予了RNAi的高效性和持久性。四大基因沉默技術(shù)是什么?基因敲除共抑制反義RNARNAi僅供參考