枯草芽孢桿菌.pdf

《枯草芽孢桿菌.pdf》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、芽孢桿菌屬的一種。單個細(xì)胞0.7～0.8×2～3微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動。革蘭氏陽性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時，常形成皺醭。需氧菌?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產(chǎn)菌；有的菌株具有強(qiáng)烈降解核苷酸的酶系，故常作選育核苷生產(chǎn)菌的親株或制取5'-核苷酸酶的菌種。在遺傳學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，對此菌的嘌呤核苷酸的合成途徑

2、與其調(diào)節(jié)機(jī)制研究較清楚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。常用培養(yǎng)基配方：1L蒸餾水+10g蛋白胨+3g牛肉膏+15-20g瓊脂能耐氧化；耐擠壓；耐在快速繁殖過程中，產(chǎn)生大量多種維生素、有機(jī)酸、氨基酸、蛋白酶（特別是堿性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，高溫，能長期耐60°C高溫，在120°C溫度下能存活20分鐘芽孢染色法是利用細(xì)菌的芽孢和菌體對染料的親合力不同的原理，用不同染料進(jìn)行著色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難，因此，當(dāng)先用一弱堿性

3、染料，如孔雀綠（malachitegreen）或堿性品紅（basicfuchsin）在加熱條件下進(jìn)行染色時，此染料不僅可以進(jìn)入菌體，而且也可以進(jìn)入芽孢，進(jìn)入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出，若再用復(fù)染液（如番紅液）或襯托溶液（如黑色素溶液）處理，則菌體和芽孢易于區(qū)分。（1）將培養(yǎng)24小時左右的枯草芽孢桿菌或其他芽孢桿菌，作涂片、干燥、固定。（2）滴加3—5滴孔雀綠染液于已固定的涂片上。（3）用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰，切忌使染液蒸干，必要時可添加少許染液。加熱時間

4、從染液冒蒸汽時開始計算約4—5分鐘。這一步也可不加熱，改用飽和的孔雀綠水溶液（約7．6％）染10分鐘。（4）傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止。（5）用番紅水溶液復(fù)染1分鐘，水洗。（6）待干燥后，置油鏡觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色?！吭趐H為5.5~8.5時生長良好，最適生長溫度為370一、目的要求1、學(xué)習(xí)分離、純化噬菌體的基本原理和方法。2、學(xué)習(xí)噬菌體效價測定的基本方法。二、基本原理因?yàn)槭删w是專性寄生物，所以自然界中凡有細(xì)菌分布的地方，均可發(fā)現(xiàn)奇特異的噬菌體的存在，亦即噬菌體是伴隨著宿主細(xì)

5、菌的分布而分布的，例如糞便與陰溝污水中含有大量大腸桿菌，故也能很容易的分離到大腸桿菌噬菌體；乳牛場有較多的乳酸桿菌，也容易分離到乳酸桿菌噬菌體等。由于噬菌體侵入細(xì)菌細(xì)胞后進(jìn)行復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)胞裂解，噬菌體即從中釋放出來，所以，（a）在液體培養(yǎng)基內(nèi)可使混濁菌懸液變?yōu)槌吻?，此現(xiàn)象可指示有噬菌體存在；也可利用這一特性，在樣品中加入敏感菌株與液體培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)，使噬菌體增殖、釋放，從而可分離到特異的噬菌體；（b）在宿主細(xì)菌生長的固體瓊脂平板上，噬菌體可裂解細(xì)菌而形成透明的空斑，稱噬菌體斑（圖1），一個噬菌體產(chǎn)生一個

6、噬菌斑，利用這一現(xiàn)象可將分離到的噬菌體進(jìn)行純化與測定噬菌體的效價。本實(shí)驗(yàn)是從陰溝污水中分離大腸桿菌噬菌體，剛分離出的噬菌體常不純，如表現(xiàn)噬菌斑的形態(tài)、大小不一致等，然后再進(jìn)一步純化。噬菌體的效價就是1毫升培養(yǎng)液中所含活噬菌體的數(shù)量。效價測定的方法，一般應(yīng)用雙層瓊脂平板法。由于含有特異宿主細(xì)菌的瓊脂平板上，一個噬菌體產(chǎn)生一個噬菌體斑，因此，能進(jìn)行噬菌體的計數(shù)。二、器材37℃培養(yǎng)18小時的大腸桿菌斜面，陰溝污水；本實(shí)驗(yàn)均用普通肉膏蛋白胨培養(yǎng)基500毫升三角瓶內(nèi)裝三倍濃縮的液體培養(yǎng)基100毫升，試管液體培養(yǎng)基，

7、瓊脂平板，上層瓊脂培養(yǎng)基（含瓊脂0.7%，試管分裝，沒管4毫升），底層瓊脂平板（含培養(yǎng)基10毫升，瓊脂2%）大腸桿菌18小時培養(yǎng)液，大腸桿菌噬菌體10-2稀釋液（用肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基稀釋）含0.9毫升液體培養(yǎng)基的小試管4支，肉膏蛋白胨瓊脂平板（10毫升培養(yǎng)基，2％瓊脂，作底層平板用），含4毫升瓊脂培養(yǎng)基的試管（0.7％瓊脂，作上層培養(yǎng)基用）5管，滅菌小試管5支，滅菌1毫升吸管10支，48℃水浴箱等。滅菌吸管，滅菌玻璃途布器，滅菌蔡氏細(xì)菌濾器，滅菌抽濾器，恒溫水浴箱，真空泵等。1、噬菌體的分離（1）制備菌

8、懸液取大腸桿菌斜面一支，加4ml無菌水洗下菌苔，制成菌懸液。（2）增殖培養(yǎng)于100ml三倍濃縮的肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中，加入污水樣品200ml與大腸桿菌懸液2ml，37℃培養(yǎng)12～24小時。（3）制備裂解液將以上混合培養(yǎng)液2500r/min離心15分鐘。將以滅菌的蔡氏過濾器用無菌操作安裝于滅菌抽濾瓶上，用橡皮管連接抽濾瓶與安全瓶，安全瓶再連接于真空泵（如圖2）。圖上的真空表接或不接均可。將離心上清夜倒入濾器，開動真空