生化工程實習(xí).說課材料.ppt

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1、生化工程實習(xí).二、實驗原理：1.Stoke’s方程式2.電泳只需兩件儀器：(1).直流電源(2).緩衝劑容器(貯池)系3.SDS-PAGE是PAGE的一種特殊型式，SDS是帶負(fù)電荷的陰離子去污劑。4.各種蛋白質(zhì)分子在SDS-PAGE中，只能按其分子量大小而分離。5.電泳技術(shù)的廣泛應(yīng)用已需要發(fā)展一種方法來用在看見大分子在丙烯醯胺膠上分離，方法如下：(1).Coomassie亮藍(lán)染色(2).螢光染色技術(shù)三、實驗儀器：1.夾心式垂直板電泳槽[凝膠模(135×100×1.5mm)]2.直流穩(wěn)壓電源(電壓300~600V，電流50~100mA)四、實驗藥品及試劑：1.分子量測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)2.連

2、續(xù)體系SDS-PAGE有關(guān)試劑(1).0.2MpH7.2磷酸鹽緩衝液：(2).樣品溶解液：(3).凝膠貯液：(4).凝膠緩衝液：(5).1%TEMED：(6).10%過硫酸銨(AP)：(7).電極緩衝液(0.1%SDS，0.1MPH7.2磷酸鹽緩衝液)：(8).1%瓊脂醣：3.不連續(xù)體系SDS-PAGE有關(guān)試劑(1).10%(W/V)SDS溶液：(2).1%TEMED(V/V)：(3).10%過硫酸銨(AP)(W/V)：(4).樣品溶解液：(5).凝膠貯液：(6).凝膠緩衝液：(7).電極緩衝液(內(nèi)含0.1%SDS，0.05MTris-0.384M甘胺酸緩衝液PH8.3)：(8).1

3、%瓊脂醣：4.固定液：5.染色液：6.脫色液：五、實驗步驟：(一)、實驗步驟(一)：1.安裝夾心式垂直板電泳槽2.配膠及凝膠板的製備(1).配膠(2).凝膠板的製備3.樣品的處理與加樣(1).樣品的處理(2).加樣4.電泳5.凝膠板剝離與固定6.染色與脫色7.繪製標(biāo)準(zhǔn)曲線(二)、實驗步驟(二)：※蛋白質(zhì)電泳-11.養(yǎng)菌菌液(100?L)+LB(100mL)+Amp(100?L)+IPTG(100?L)(1).配製培養(yǎng)基200mL–利用250mL錐形瓶(2).調(diào)整PH值(PH=7.0)(3).分裝於2瓶錐形瓶(每瓶錐形瓶100mL)，並於每瓶錐形瓶用鋁鉑封口。(4).置於滅菌鍋滅菌，操

4、作時間約1小時(5).滅完菌後，取出冷卻(6).於錐形瓶中加入100?L的菌種、100?L的Amp及100?LIPTG.(於無菌操作臺操作)(7).置於恆溫振盪器中培養(yǎng)16小時※蛋白質(zhì)電泳-21.養(yǎng)菌：菌液(100?L)+LB(100mL)+Amp(100?L)+IPTG(100?L)2.離心，上層液不要，取下層沈澱物。3.每支有沈澱物的離心管中加5mL磷酸緩衝液(Pibuffer)溶解沈澱物[用玻棒溶解沈澱物]4.溶解沈澱物均勻後，利用超音波震破機震破細(xì)胞的細(xì)胞壁[若酵素為胞外酵素，則不需此程序；若酵素為胞內(nèi)酵素，則需此程序?qū)⑸驖瘴镎鹌?，以能取出胞?nèi)酵素]5.震破完後，離心，取上層

5、液(即為酵素液)[而下層為細(xì)胞壁的殘骸，則滅菌後丟棄]6.上層液，測酵素活性：(1).活性測試法：?.先取5支1.5mL的離心管，每支加入200uL膠狀chitin。?.離心完成後，先在2~5支加入800uL上層液(酵素液)，將2~5置入37℃恆溫槽(維持酵素有活性)，並開始記時。?.而第1支(當(dāng)Blank用)則加入800uL的上層液(酵素液)，並加入200uL的DNS溶液，置入95℃恆溫槽(破壞酵素活性)，反應(yīng)10min。?.其餘2~5支置入37℃恆溫槽，每30分鐘取1支出來，再加入200uLDNS溶液，在95℃反應(yīng)10min，其餘以此類推。?.觀察是否有顏色變化，若愈來愈深的話表

6、示此酵素液中含有此酵素。7.酵素純化8.跑蛋白質(zhì)電泳(SDS-PAGE)(1).gel之配製.玻璃置入組合架上，螺絲對角鎖緊.裝入支撐架上，螺絲向內(nèi)，有一響聲.測試是否有漏水，水裝至小玻璃頂端，若沒有漏水，則將水倒掉，再用拭鏡紙將水吸乾。.依配方配製好runninggel後，倒入大小玻璃之夾縫中，液位約在組合架凹洞的底端。.再加入n-butanol用以壓平gel的液面.待gel凝固後，則倒掉n-butanol後，可用水沖洗，再用拭鏡紙吸乾gel之液面水分.將配製好的stackinggel倒入大小玻璃的夾縫中(不能有氣泡)[TEMED最後加入，再立即倒入，否則stacki

7、nggel很容易凝固].立刻置入齒梳，愈接近runninggel愈好。.凝固後(可用烘箱)，取出組合架，置入電泳槽中.槽中需放有4Xrunningbuffer.將置入槽中之組合架中的gel之齒狀凹洞中，用注射筒吸取runningbuffer清洗每個齒狀凹洞。.一切就緒後，開始注入處理過的sample及markerA.各管取30?Lsample置入1.5mLtube中，再加入5?L之5XsamplebufferB.輕微離心C.取5?L之protei