資源描述：
《Westernblot實(shí)驗(yàn)原理和實(shí)驗(yàn)步驟.ppt》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、Westernblotting基本原理和實(shí)驗(yàn)步驟為什么要做蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)？研究一些體外的蛋白質(zhì)分子，尋找目的蛋白是否存在樣品當(dāng)中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，在不同的樣品中，樣品之間的表達(dá)差異性。目錄1Westernblot基本原理2蛋白免疫印跡的組成3Westernblot一般流程4Westernblot常見問題分析1WesternBlot基本原理WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。SDS-PAGE可對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移到固相載體——例如PVDF膜上。固相載體可以吸
2、附蛋白質(zhì)，并保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。轉(zhuǎn)移后的PVDF膜就稱為一個(gè)印跡（blot），用蛋白溶液（如5%BSA或脫脂奶粉溶液）處理，封閉PVDF膜上的疏水結(jié)合位點(diǎn)。用目標(biāo)蛋白的抗體（一抗）處理PVDF膜——只有待研究的蛋白質(zhì)才能與一抗特異結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，這樣清洗除去未結(jié)合的一抗后，只有在目標(biāo)蛋白的位置上結(jié)合著一抗。用一抗處理過的PVDF膜再用標(biāo)記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗就是抗鼠IgG的抗體。處理后，帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合形成抗體復(fù)合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。2組成蛋
3、白免疫印跡（Westernblotting或Immunoblotting）一般由凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學(xué)檢測三個(gè)部分組成。第一步:是做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測樣品中的蛋白質(zhì)按分子量大小在凝膠中分成帶。第二步：把凝膠中已分成條帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纖維素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白轉(zhuǎn)移的方法多用電泳轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)移電泳），它又有半干法和濕法之分，電轉(zhuǎn)移主要方法有垂直的槽式和水平的半干式兩種。第三步：是用自特異性的抗體檢測出已經(jīng)印跡在膜上的所要研究的相應(yīng)抗原。免疫檢測的方法可以是直接的和間接的?，F(xiàn)在多用間接免疫
4、酶標(biāo)的方法，在用特異性的第一抗體雜交結(jié)合后，再用酶標(biāo)的第二抗體（堿性磷酸酶（知AP）或辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗第一抗體的抗體）雜交結(jié)合，再加酶的底物顯色或者通過膜上的顏色或X光底片上暴光的條帶來道顯示抗原的存在。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白表達(dá)水平的檢測中。3Westernblot流程圖WesternBlot一般流程1蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交洗膜二抗雜交洗膜底物顯色蛋白樣品的制備21、細(xì)胞的處理：1、細(xì)胞計(jì)數(shù)，取5*10^4/well，500g離心5min。加入200ulPBS混勻，500g離心5min。去掉廢液加
5、入15ulPBS再加入5ul5Xloadingbuffer，100C煮沸10min，冰上放置5min，稍離心。2、分泌蛋白的提取：取15ul細(xì)胞上清，加入5ul5Xloadingbuffer，100C煮沸10min，冰上放置5min，稍離心。3SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳4分離膠濃度與蛋白分離范圍5制膠1）裝好架子，固定好玻璃板。2）注水試漏。3）倒水，甩干，用濾紙吸凈殘留水份。4)按照下面配方配制12%分離膠。一般1.5玻璃板需膠6.5-7ml，1.0玻璃板需膠4.5ml。5)將膠慢慢倒入，防止有氣泡產(chǎn)生。6）在膠上面加入一層蒸餾水，可以將膠里的氣
6、泡壓出、將膠面壓平并防止頂層膠風(fēng)干。7)待分離膠凝集后（至少20度，30min），配制濃縮膠5％。6制膠過程注意事項(xiàng)操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)其，以免漏膠加完分離膠后，加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。分離膠充分凝固就倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。7上樣與電泳將制備好的樣品溶解后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。濃縮膠用70V電壓，當(dāng)樣品至分離膠時(shí)，用120V電壓，至溴酚蘭跑到底時(shí)停止電泳。電泳時(shí)常遇到的問
7、題︶條帶呈笑臉狀，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。 ︵條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。 拖尾：樣品溶解不好。 紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。 條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜。 條帶兩邊擴(kuò)散：加樣量過多。8轉(zhuǎn)膜在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至固相載體（膜）上。膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF等。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性。有兩種規(guī)格：Immobilon-P（0.45
8、um）和Immobilon-PSQ(0.2umforMW<20kDa)。槽式濕轉(zhuǎn)法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中
