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1、實驗四高效液相色譜法測定VE含量1實驗?zāi)康?.1了解高效液相色譜儀的基本操作；1.2了解高效液相色譜儀測定VE的原理。2實驗原理高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱（固定相）內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對運動時，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附—解吸的分配過程，各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。VE（維生素E）又名生育酚或產(chǎn)妊酚，在食油、水果
2、、蔬菜及糧食中均存在。有抗氧化作用，能增強皮膚毛細血管抵抗力，并維持正常通透性；有改善血液循環(huán)及調(diào)整生育功能、抗衰老作用等。VE通過高效液相色譜柱進行分離，PDA檢測器檢測，外標(biāo)法定量。3實驗器材3.1實驗樣品VE樣品溶液3.2實驗試劑濃度為50μg/ml的VE標(biāo)樣3.3實驗儀器高效液相色譜儀附PDA檢測器4色譜條件色譜柱：C18柱；流動相速度：0.3ml/min；進樣量：5μl；柱溫：30℃。5實驗結(jié)果與討論5.1實驗結(jié)果本次實驗采用的是單點法測定。實驗結(jié)果見表1。表1.液相色譜儀測定蘋果的VE含量進樣量保留時間峰面積標(biāo)樣5μl3.59min42217待測樣品5μl3.59min1736
3、9樣品中VE的濃度=乙烯標(biāo)樣的總量×蘋果的峰面積/乙烯標(biāo)樣的峰面積=5μl×50μg/mL×17369/（5μl×42217）=20.57μg/mL5.2實驗討論本次實驗中，測定標(biāo)樣溶液VE含量時，在指定的保留時間內(nèi)并未出峰。討論分析原因：樣品溶液在上周實驗后，一直置于離心管中，未避光低溫保存，導(dǎo)致樣品中VE氧化，液相測定時沒有在相應(yīng)的時間出峰。本次實驗時間較短，且主要目的是了解高效液相色譜儀的基本操作，以及液相色譜儀測定VE的原理，故結(jié)合前組同學(xué)對VE含量的測定數(shù)據(jù)進行討論與分析。因時間有限，實驗采用了單點法進行測量分析，且無平行重復(fù)，這樣誤差較大。我們以后實驗時，VE標(biāo)樣可以選擇5個濃
4、度，每個濃度分別測定3-4次，取其峰面積的平均值后作標(biāo)準(zhǔn)曲線，這樣誤差更小。6知識擴展6.1高效液相色譜儀包括哪幾個部分組成？答：高效液相色譜儀主要由輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、色譜分離系統(tǒng)、檢測器這四個部分組成，其流程圖見圖1。輸液系統(tǒng)包括貯液槽和輸液管道、高壓泵和梯度洗脫裝置。貯液槽，通常是由玻璃或不銹鋼等材料制成的，用來存貯足夠數(shù)量、符合分析要求流動相的容器。輸液管道是管道內(nèi)徑很小的用于連接高效液相色譜儀各主要流路系統(tǒng)。高壓泵是將流動相在高壓下連續(xù)送入色譜柱，使樣品在色譜柱內(nèi)完成分離過程。高效液相色譜儀采用的是往復(fù)式恒流泵，是具有輸出壓力高、流量穩(wěn)定、流量可調(diào)范圍寬、泵內(nèi)死體積小、具有梯度洗
5、脫及耐酸堿腐蝕、溶劑更換迅速等性能。梯度洗脫裝置是在分離過程中，隨時間函數(shù)程序改變流動相組成，有分低壓梯度和高壓梯度兩種裝置。圖1高效液相色儀流程圖進樣系統(tǒng)有由進樣口、注射器、流通閥和定量管等組成，其作用是使樣品有效地送入色譜柱。進樣系統(tǒng)是柱外效應(yīng)的重要來源之一，為了減少對柱高的影響，避免由柱外效應(yīng)而引起峰展寬。進樣口要求死體積小，這樣能使樣品各組分幾乎同時進入色譜柱。色譜分離系統(tǒng)由色譜柱、柱恒溫器組成。色譜柱由柱管和固定相構(gòu)成，分為普通分析柱（內(nèi)徑大約4~5mm）、半制備或制備柱（內(nèi)徑大于8mm）、窄柱（內(nèi)徑在2mm左右）以及微徑柱（內(nèi)徑小于1mm），內(nèi)徑小的色譜柱相對更省溶劑，相對靈敏
6、度更高。柱恒溫箱是另一個重要的組成，柱溫是液相色譜的重要操作參數(shù)。高精度的溫度控制對保證色譜柱性能，進行高精度、高重現(xiàn)性的分析是比不可少的。高效液相色譜儀的檢測器有紫外-可見光檢測器、熒光檢測器、示差折光檢測器和二極管陣列檢測器。6.1操作高效液相色譜儀時需要注意哪些問題？答：操作高效液相色譜儀時應(yīng)注意：1）配置樣品時要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)配制對照品濃度（低濃度），不可超過或低于一倍。2）所需玻璃儀器和容器，盡量選用棕色容量瓶進行配制。每次臨用前需要用純水清洗干凈后，再用無水乙醇沖洗三次，陰（烤）干、冷卻后方可使用。3）實驗前要檢查儀器是否存在漏液現(xiàn)象、壓力是否穩(wěn)定、柱子是否安反。檢查完畢后，打開
7、電腦、工作站電源開關(guān)后，再打開泵電源開關(guān)、控制面板上泵開關(guān)。先用色譜甲醇沖洗柱子，等待機器平穩(wěn)后，再打開檢測器電源開關(guān)、控制面板上檢測器開關(guān)。30分鐘后方可進針做實驗。4）對照品與樣品進樣量要盡量保持一致，樣品峰面積與對照品峰面積盡量保持一致（不要超過一倍，可適當(dāng)調(diào)整進樣量或稀釋倍數(shù)）。5）注意系統(tǒng)評價：理論板數(shù)（達到標(biāo)準(zhǔn)要求）、分離度（大于1.5）、拖尾因子（0.95-1.05之間）。6）平行進針要求RSD<2％，進樣
