糞便-病原菌的分離與鑒定.ppt

《糞便-病原菌的分離與鑒定.ppt》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、糞便標(biāo)本2病原菌的分離與鑒定1實(shí)驗?zāi)康募S便標(biāo)本中常含有很多雜菌，應(yīng)根據(jù)檢驗?zāi)康木牟煌x擇培養(yǎng)基，以利于病原菌的檢出。而且，因其各種正常菌群含量甚多，僅以染色性和形態(tài)無法分辨是否為病原菌。常見的病原菌有志賀氏菌屬、致病性大腸桿菌屬、弧菌屬、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、艱難梭菌等。這次實(shí)驗中我們從糞便標(biāo)本中檢出的是大腸埃希菌、痢疾志賀菌。而且，我們從這次的綜合性實(shí)驗中了解到了醫(yī)學(xué)微生物學(xué)主要的研究方法和手段，掌握了微生物試驗的基本技能和基本原理，樹立了牢固的無菌觀念。同時培養(yǎng)了我們的動手能力和表達(dá)能力。2糞便標(biāo)本直接糞便檢查革蘭染色單染色動力觀察及制動試驗初步結(jié)果報告需氧培養(yǎng)增菌培養(yǎng)直

2、接分離堿性胨水堿性平板分離菌落形態(tài)抗血清凝集生化反應(yīng)增菌液菌落形態(tài)抗血清凝集生化反應(yīng)SS平板副溶血性弧菌選擇性平板菌落形態(tài)生化反應(yīng)厭氧培養(yǎng)微需氧培養(yǎng)及特殊培養(yǎng)實(shí)驗結(jié)果31.實(shí)驗材料接種針、接種環(huán)、油性筆、打火機(jī)、試管架、普通冰箱、冷藏室、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、奧林巴斯CX21型生物顯微鏡、1500W電爐、蒸餾水、玻片缸、消毒液、1‰新潔而滅、天平、砝碼、細(xì)菌干粉培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、半固體瓊脂）、錐形瓶、量筒、試管筐、糖發(fā)酵微量管（葡萄糖、乳糖）、滅菌平皿、試管（棉塞）、刻度吸管、洗耳球、稱量紙、硫酸紙、牛皮紙、橡皮筋、尺子、藥勺、革蘭氏染色液（結(jié)晶紫染液、盧戈碘液、95％乙醇

3、、稀釋石炭酸復(fù)紅）、小砂輪、痢疾血清、青霉素、鏈霉素、慶大霉素和生理鹽水濾紙片、線繩、香柏油、擦油紙42.實(shí)驗方法2.1培養(yǎng)基的制備、消毒和滅菌培養(yǎng)基制備的一般程序：調(diào)配→溶化→矯正pH→分裝→滅菌→檢定→保存。干粉培養(yǎng)基→蒸餾水→加熱溶化→分裝→滅菌→檢定→保存。干粉培養(yǎng)基→蒸餾水→加熱溶化→分裝→集中放在試管筐里，然后罩上硫酸紙，牛皮紙，用橡皮筋扎好→放入講臺邊的高壓滅菌桶或高壓滅菌筐內(nèi)→送到高壓滅菌室（洗刷室）。5表1.培養(yǎng)基的制備組號培養(yǎng)基稱量(g)水量(ml)煮沸(次)分裝(ml)備注(24人分)1營養(yǎng)瓊脂11.43003瓶，500ml瓶，平板2,3營養(yǎng)瓊脂2.975351

4、5支，中試管，斜面6營養(yǎng)肉湯2.0901330支，小試管，液體7,8半固體1.5503315支，小試管，高層62.2細(xì)菌的分離與培養(yǎng)2.2.1采用平板劃線分離法，將取糞便標(biāo)本中混雜的多種細(xì)菌，在伊紅美藍(lán)固體培養(yǎng)基表面劃線，使之分散成單個細(xì)菌，在37℃培養(yǎng)24h，從而分離出肉眼可見的單個菌落。2.2.2細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長特征的觀察。觀察形成菌落的大小、形狀、邊緣、表面、溶血性、色素、透明度、濕潤度。2.2.3細(xì)菌的純培養(yǎng)。糞便標(biāo)本在伊紅美藍(lán)平板上，有紫黑色、粉紅色兩種菌落。挑選這兩種不同菌落分別在斜面培養(yǎng)基上接種，標(biāo)記，在37℃培養(yǎng)18h。2.2.4細(xì)菌在斜面培養(yǎng)基上生長特征的觀察

5、。觀察細(xì)菌的生長量、菌苔形狀、表面形狀、光澤、透明度、顏色等。2.2.5液體培養(yǎng)基接種法。用接種環(huán)在固體或斜面培養(yǎng)基上挑選紫黑色和粉紅色菌苔少許移入液體培養(yǎng)基管中，在接近液面的管壁上輕輕研磨，并沾取少量肉湯調(diào)和，使菌液混合于培養(yǎng)基中，混勻。在35℃培養(yǎng)4~6h，觀察細(xì)菌的生長情況72.3細(xì)菌個體形態(tài)特征的觀察2.3.1取兩塊玻片，在每塊玻片上加生理鹽水3～4ul，2滴，在斜面培養(yǎng)基上取紫黑色菌苔少許（1mm小菌落的半量）與第一塊玻片上的一滴鹽水混勻，再取粉紅色菌苔少許（1mm小菌落的半量）與第二塊玻片上的一滴鹽水混勻，涂成1cm2；做好標(biāo)志。經(jīng)在空氣中干燥后，再用酒精燈對其進(jìn)行固定。

6、2.3.2革蘭染色。用結(jié)晶紫對以上兩塊已固定的玻片進(jìn)行初染1分鐘，水洗；再用盧戈碘液媒染1分鐘，水洗；然后用95％乙醇對其進(jìn)行脫色約20秒鐘，水洗；最后用稀釋復(fù)紅復(fù)染1分鐘，水洗；吸干，在顯微鏡下鏡檢。82.4細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定2.4.1糖發(fā)酵試驗。用接種針分別挑少許紫黑色和粉紅色的細(xì)菌接種到葡萄糖發(fā)酵微量管和乳糖發(fā)酵微量管中，將微量管放在平皿蓋內(nèi)，在37℃下，培養(yǎng)24小時，觀察其產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況。2.4.2細(xì)菌藥物敏感性試驗。接種環(huán)分別取紫黑、粉紅色兩種菌液3～6ul×2環(huán)，各自在兩個平板上，作平板密集劃線接種細(xì)菌（紗窗樣）。設(shè)計三點(diǎn)，三點(diǎn)之間等邊三角距離，點(diǎn)距離平皿邊緣約15mm。作標(biāo)

7、記：青、鏈、慶。鑷子火焰消毒，夾取相應(yīng)的藥物紙片，平貼在已設(shè)定的位置上，按壓，最后鑷子火焰滅菌。37℃18～24小時培養(yǎng)，觀察結(jié)果。2.4.3半固體接種法。接種針斜面取紫黑和粉紅色的細(xì)菌，各自接種進(jìn)兩個半固體培養(yǎng)基，從半固體培養(yǎng)基中心，垂直刺入，到達(dá)培養(yǎng)基底部4/5處，再循原來的路線，退出接種針。在37℃下,培養(yǎng)24小時，觀察結(jié)果。2.4.4痢疾血清玻片凝集反應(yīng)。取載玻片1張，滴加痢疾血清和生理鹽水各15ul，2滴。用接種環(huán)挑取少許紫黑色菌落和粉紅色菌落，