銀杏內(nèi)酯對ccl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷作用探究

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1、銀杏內(nèi)酯對CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷作用探究　　[摘要]目的探討銀杏內(nèi)酯對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法隨機(jī)將50只SD小鼠分為5組，分別為空白對照組、模型組、銀杏內(nèi)酯低劑量組、銀杏內(nèi)酯中劑量組和銀杏內(nèi)酯高劑量組。采用CCl4腹腔注射和灌胃制作小鼠肝損傷模型。通過觀察肝臟的解剖學(xué)形態(tài)，檢測血丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平來評估銀杏內(nèi)酯對小鼠肝臟的保護(hù)作用。Realtime-PCR檢測孕烷X受體（PXR）、CYP3A11、CYP3A13和RXRα的表達(dá)。結(jié)果與空白對照組相比，模型組小鼠肝臟

2、表面粗糙、輪廓萎縮；血清ALT和AST水平明顯升高。與模型組相比，銀杏內(nèi)酯組小鼠肝臟表面光滑、輪廓清晰；血清ALT和AST水平明顯降低，肝臟PXR、RXRα、CYP3A13和CYP3A11表達(dá)水平明顯升高。結(jié)論銀杏內(nèi)酯對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷有一定的保護(hù)和修復(fù)作用，其保護(hù)效果呈明顯劑量依賴性。PXR、RXRα、CYP3A13、CYP3A11基因表達(dá)的上調(diào)可能在小鼠肝損傷保護(hù)中起重要作用。[關(guān)鍵詞]銀杏內(nèi)酯；CCl4；肝損傷[中圖分類號]R285.5[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1674-4721（2014）02（b）-0011-0

3、44銀杏葉提取物主要成分為黃酮類和內(nèi)酯類化合物，其中內(nèi)酯類化合物包括銀杏內(nèi)酯A、B、C、M、J。銀杏內(nèi)酯具有抗炎、抗氧化、抗過敏等藥理作用，可治療消化系統(tǒng)、中樞系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等疾病[1-3]。目前肝臟損傷的預(yù)防和治療是全球范圍的一個嚴(yán)峻課題。目前臨床主要通過建立和應(yīng)用與人類肝臟發(fā)病機(jī)制類似的動物模型，來探討各種肝臟疾病發(fā)病機(jī)制和篩選各種治療藥物[4]。孕烷X受體（PXR）是一種體內(nèi)內(nèi)源和外源性物質(zhì)代謝過程中的調(diào)節(jié)因子，它能夠被許多內(nèi)源性物質(zhì)激活，包括孕烷、膽汁酸、維生素和激素[5]。隨著小鼠和人的PXR基因首次成功克隆，

4、研究發(fā)現(xiàn)PXR不僅能夠被目前熟知的許多調(diào)節(jié)CYP3A表達(dá)的化合物所激活，還能結(jié)合到許多CYP3A基因啟動子區(qū)域的響應(yīng)元件上[6-8]。研究表明，銀杏內(nèi)酯能激活小鼠體內(nèi)PXR，進(jìn)而抑制人肝臟成纖維母細(xì)胞的增殖[9-11]。RXRα、CYP3A11和CYP3A13在功能上與PXR密切相關(guān)，但是這三種細(xì)胞因子與小鼠肝損傷相關(guān)的研究報(bào)道較少。本文研究銀杏內(nèi)酯對CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷后肝功能的影響，初步探討銀杏內(nèi)酯在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷中的作用機(jī)制。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動物：SD雄性小鼠，重18～22g，購自吳氏實(shí)驗(yàn)動物中心。

5、主要試劑：銀杏內(nèi)酯購自臨沂愛康藥業(yè)有限公司，Real4time-PCR試劑盒購自大連寶生物公司，ALT和AST檢測試劑盒購自上海復(fù)星長征公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物公司。主要儀器：全自動凝膠成像分析系統(tǒng)（JS-380A型，上海培清科技有限公司），熒光定量PCR擴(kuò)增儀（TP800，大連寶生物公司），倒置顯微鏡（XDS-1B型，重慶），全自動生化分析儀（邁瑞B(yǎng)S200，中國邁瑞公司），離心機(jī)（1-15，德國STARTORIUS公司），熒光定量PCR擴(kuò)增儀（TP800，TAKARA）。1.2方法1.2.1動物分組將50只SD雄性小鼠

6、隨機(jī)分為5組：空白對照組、模型組、銀杏內(nèi)酯低劑量組、銀杏內(nèi)酯中劑量組、銀杏內(nèi)酯高劑量組，每組10只。1.2.2給藥方法銀杏內(nèi)酯低、中、高劑量組小鼠每天分別采用銀杏內(nèi)酯0.3、0.6、1.2g/kg灌胃，連續(xù)2周，第15天隔夜禁食后，模型組和銀杏內(nèi)酯組小鼠腹腔注射0.2%CCl4橄欖油溶液0.02ml/g，空白對照組注射等劑量橄欖油，48h后處死。1.2.3血清AST和ALT活性測定處死小鼠前眼球取血，離心獲得血清，用ALT、AST檢測試劑盒進(jìn)行檢測。1.2.4形態(tài)學(xué)觀察解剖觀察小鼠肝臟形態(tài)、色澤，取5mm×5mm×3mm大小的肝組

7、織，制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色，觀察小鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、壞死程度和炎癥等。1.2.5RealTime-PCR檢測4提取小鼠肝臟總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，采用Realtime-PCR檢測RXRα、PXR、CYP3A11、CYP3A13表達(dá)情況，各引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系：2.5×SYBRMix12.5μl，10μmol/L上下游引物各0.5μl，模板2.0μl，ddH2O9.5μl，共25μl。表1RT-PCR實(shí)驗(yàn)中各基因的檢測引物序列1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±

8、s）表示，組間比較采用方差分析或t檢驗(yàn)，以P　　2.2小鼠血清AST、ALT水平測定模型組小鼠血清AST和ALT水平明顯高于空白組（P0.05）。銀杏內(nèi)酯低、中、高劑量組小鼠血清ALT、AST水平都高于空白對照組，銀杏內(nèi)酯劑量越高，ALT、AST水