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1、dsRNA和RNA干擾技術(shù)綜述***審校彭**(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院)摘要：dsRNA在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)同源序列的基因表達(dá)受抑的現(xiàn)象稱為RNA干擾。其機(jī)理的日漸闡明使它有可能在基因敲除，基因功能測定等方面成為一項(xiàng)成熟的技術(shù)，這將在生命科學(xué)領(lǐng)域中引起深刻變化。本文就dsRNA和RNA干擾的關(guān)系，RNA干擾的機(jī)制和特點(diǎn),RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用前景等作一綜述。關(guān)鍵詞：dsRNA;RNA干擾;RNA干擾技術(shù);基因沉寂外源和內(nèi)源性雙鏈RNA（double-strandedRNAdsRNA）在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)同源序列的基因表達(dá)受抑的現(xiàn)象稱為RNA干擾。早在十年前，
2、科學(xué)家們在向牽牛花轉(zhuǎn)導(dǎo)色素合成基因時，觀察到“共抑制”（cosupression）,不僅是轉(zhuǎn)入的基因?yàn)楸磉_(dá)，而且自身的色素合成也減弱了。相似的現(xiàn)象還發(fā)生在真菌的研究中，當(dāng)把合成類胡蘿卜素的基因轉(zhuǎn)入到紅色面包霉中時，卻導(dǎo)致了大約30％轉(zhuǎn)染細(xì)胞自身基因的失活，這種現(xiàn)象稱為“緩解”（quelling）。但是這種現(xiàn)象一直得不到令人信服的解釋。1998年，在研究秀麗隱桿線蟲基因沉默機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，將反義RNA、正義RNA和雙鏈RNA分別導(dǎo)入蟲體內(nèi)，作為對照組的正義核酸，雖不能與活性基因或mRNA結(jié)合，卻同反義核酸有相似的阻斷基因表達(dá)能力，與反義RNA
3、傳統(tǒng)機(jī)制相違背、而另人驚奇的是，雙鏈RNA較正義RNA和反義RNA能更高效地阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)，一直基因表達(dá)的效率比單鏈RNA至少高2個數(shù)量級。Fire等稱這種現(xiàn)象為RNA干擾現(xiàn)象。RNA干擾現(xiàn)象已證實(shí)在一系列的生物中存在，包括植物[1]、真菌[2]、錐蟲[3]、囊蟲[4]、果蠅[5]和線蟲[6]。新近科學(xué)家在哺乳動物細(xì)胞中也觀察到了這一現(xiàn)象[7]。生物界普遍存在的RNA干擾現(xiàn)象給現(xiàn)代生命科學(xué)所帶來的沖擊將是無法估量的，它將不僅能提供一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段，而且有可能在基因功能測定，基因治療等方面開辟一條新思路。8
4、一、dsRNA的形成由于dsRNA抑制基因表達(dá)具有潛在高效性，正常機(jī)體任何導(dǎo)致dsRNA形成的情況都會引起不需要的相應(yīng)基因沉寂。所以正常機(jī)體內(nèi)各種基因有效表達(dá)顯然需要一套嚴(yán)密防止dsRNA形成的機(jī)制。這些機(jī)制包括：在進(jìn)化水平上淘汰那些在兩條DNA鏈上相應(yīng)位置上都有啟動子的基因，否則兩條DNA鏈同時轉(zhuǎn)錄出兩條互補(bǔ)的RNA就可能形成dsRNA；在正常生理?xiàng)l件下dsRNA的形成必須具有一定的條件如兩條互補(bǔ)RNA鏈相遇，互相識別和一定濃度的RNA連接蛋白存在；在偶然情況下形成的dsRNA還必須具有抵御解鏈，共價修飾和降解雙鏈RNA等酶作用的能力
5、。此外，細(xì)胞對于外來的RNA和自身轉(zhuǎn)錄過程中生成的變異RNA（aberrantRNA）所產(chǎn)生的dsRNA引發(fā)RNA干擾能力大于擁有自身mRNA序列的dsRNA。與這些設(shè)想一致的實(shí)驗(yàn)在線蟲和錐蟲中得到證實(shí)[8]。引發(fā)RNA干擾的dsRNA產(chǎn)生機(jī)制是通過對RNA干擾現(xiàn)象深入研究推斷而來的。它包括內(nèi)源性和外源性兩個方面：RNA干擾作為一種防御外來核酸的免疫機(jī)制，外來核酸（包括DNA和RNA）的侵入就可能導(dǎo)致dsRNA的產(chǎn)生，如RNA病毒的入侵，DNA病毒在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，基因工程中導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因，插入逆轉(zhuǎn)的DNA片段等；內(nèi)源性的dsRNA產(chǎn)生主要是通
6、過RNA依賴的RNA合成酶（RDRP）的作用，它催化合成與機(jī)體轉(zhuǎn)錄過程中形成的異常RNA互補(bǔ)RNA鏈而形成dsRNA[9]。8二、dsRNA介導(dǎo)RNA干擾的機(jī)制1998年AndrewFire將dsRNA導(dǎo)入線蟲內(nèi)觀察到RNA干擾現(xiàn)象后[6]，科學(xué)家又在一系列的低等生物中觀察到同樣的現(xiàn)象，然而將dsRNA（長度＞30bp）導(dǎo)入常用哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)株時卻不能觀察到特異的RNA干擾現(xiàn)象，而是出現(xiàn)誘生干擾素，活化核糖核酸酶L，細(xì)胞的基因表達(dá)全面受抑和細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象[5，9]。這不禁使人疑問，哺乳動物中能不能被dsRNA誘導(dǎo)出RNA干擾。但是，實(shí)
7、驗(yàn)證明，小鼠的卵母細(xì)胞和早期的胚胎中卻存在這一現(xiàn)象[10]。隨后，Zamore的研究小組發(fā)現(xiàn)誘發(fā)RNA干擾時dsRNA被切成21-25個堿基的RNA片段[11]，同樣，這些小片段的RNA也在果繩細(xì)胞外RNA干擾模型中出現(xiàn)[12]?？茖W(xué)家把這種小片段的RNA稱為小干擾RNA（smallinterferingRNAsiRNA），并且猜測RNA干擾正是由siRNA誘導(dǎo)。ElbashirSM工作組將體外合成的21nt的siRNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)株中也檢測到了特異的RNA干擾現(xiàn)象[7]。如圖所示：內(nèi)源性dsRNA在細(xì)胞內(nèi)ATP和Dicer酶作
8、用下切割為小片段干擾的干擾RNA，siRNA和另外幾種蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）。RISC結(jié)合與siRNA互補(bǔ)的同源基因的mRNA后，mRNA被復(fù)合物中具有RNA酶作用蛋白酶降解。從而導(dǎo)
