western blot詳解(原理、分類(lèi)、試劑、步驟及問(wèn)題解答)

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1、四、WESTBLOTTINGWesternBlot詳解(原理、分類(lèi)、試劑、步驟及問(wèn)題解答)作者：佚名文章來(lái)源：本站原創(chuàng)點(diǎn)擊數(shù)：12403更新時(shí)間：2009-9-309:50:44Western免疫印跡（WesternBlot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過(guò)融合部分的抗體檢測(cè)。本文主要通過(guò)以下幾個(gè)方面來(lái)詳細(xì)地介紹一下WesternBlot技術(shù):一、原理二、?分類(lèi)i.放射自顯影ii.底物化學(xué)發(fā)光ECLECFiv.底物DAB呈色

2、三、?主要試劑四、?主要步驟五、?實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)的問(wèn)題指南1.參考書(shū)推薦2.針對(duì)樣品的常見(jiàn)問(wèn)題3.抗體4.濾紙、膠和膜的問(wèn)題5.Marker的相關(guān)疑問(wèn)6.染色的選擇7.參照的疑問(wèn)8.緩沖液配方的常見(jiàn)問(wèn)題9.條件的摸索10.方法的介紹11.結(jié)果分析一、?原理與Southern或Northern雜交方法類(lèi)似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，

3、且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。二、分類(lèi)現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實(shí)驗(yàn)條件的是用第一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買(mǎi)現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡(jiǎn)單，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過(guò)氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光

4、，就可洗出條帶。?三、主要試劑1、?丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺，應(yīng)以溫?zé)?以利于溶解雙丙稀酰胺)的去離子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亞甲雙丙烯酰胺儲(chǔ)存液丙稀酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)儲(chǔ)于棕色瓶，4℃避光保存。嚴(yán)格核實(shí)PH不得超過(guò)7.0，因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的。使用期不得超過(guò)兩個(gè)月，隔幾個(gè)月須重新配制。如有沉淀，可以過(guò)濾。2、?十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去離子水配制，室溫

5、保存。3、?分離膠緩沖液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀釋到100ml終體積。過(guò)濾后40C保存。4、?濃縮膠緩沖液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml1mol/LHCL調(diào)至pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過(guò)濾后40C保存。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調(diào)節(jié)PH值，而不用Tris.CL。5、?TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化過(guò)

6、硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時(shí)，聚合反應(yīng)受到抑制。10%(w/v)過(guò)硫酸胺溶液。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數(shù)ml，臨用前配制.6、?SDS-PAGE加樣緩沖液:pH6.80.5mol/LTris緩沖液8ml，甘油6.4ml，10%SDS12.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍(lán)1.6ml，H2O32ml混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質(zhì)樣品混合，在沸水終煮3min混勻后再上樣，一般為20-25ul，總蛋白量100μg。7、?Tris-甘氨酸電泳緩沖液:

7、30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000ml，得0.25mol/LTris-1.92mol/L甘氨酸電極緩沖液。臨用前稀釋10倍。8、?轉(zhuǎn)移緩沖液：配制1L轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱(chēng)取2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37gSDS，并加入200ml甲醇，加水至總量1L。9、?麗春紅染液儲(chǔ)存液：麗春紅S2g三氯乙酸30g磺基水楊酸30g加水至100ml用時(shí)上述儲(chǔ)存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用后應(yīng)予以廢棄。10、?脫脂奶粉5%(w/v)。11、?NaN30.02%疊氮鈉(有毒

8、，戴手套操作)，溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。12、?Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。13、?Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、?過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體。15、?NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。16、?BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。17、?100mmol/