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《western blot 相關(guān)試劑及步驟》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、WesternBlot蛋白測(cè)定步驟三蒸水制備后需要高壓消毒一、組織的采集(一)器材和試劑準(zhǔn)備:鑷子、眼科剪、70%乙醇(三蒸水配制)、1.5mL離心管、液氮(二)步驟(以心臟為例):1、脫頸椎處死小鼠,讀取小鼠編號(hào)2、乙醇消毒胸部,剪開(kāi)胸腔,剪下心臟(一顆心臟約100mg),排除血液,放入離心管,投入液氮中3、組織于-80攝氏度凍存二、組織蛋白的提?。海ㄒ唬┢鞑暮驮噭?zhǔn)備:4mL離心管、15mL管、研磨機(jī)、鑷子、冰盒、離心機(jī)、RIPA蛋白裂解液(RadioImmunoprecipitationAssay,詳見(jiàn)下載的網(wǎng)頁(yè))(碧云天公司)、PMSF
2、(Phenylmethanesulfonylfluoride,苯甲基磺酰氟,詳見(jiàn)下載的網(wǎng)頁(yè)prod號(hào)36978,ThermoScientific)、70%乙醇、三蒸水(二)步驟1、準(zhǔn)備好三管10mL70%乙醇、一管三蒸水;取出RIPA和PMSF解凍2、按照1mLPIRA:10uLPMSF:100mg組織的比例,加試劑和組織于4mL離心管3、按照三管10mL70%乙醇、一管三蒸水的順序依次洗滌研磨鉆頭(每管5秒),再研磨組織,上下且圓周運(yùn)動(dòng)離心管。每管研磨的轉(zhuǎn)速和時(shí)間保持一致。當(dāng)出現(xiàn)大量泡沫時(shí)即可停止4、靜置于冰盒30分鐘5、12000rpm,4
3、攝氏度,30分鐘6、先取100uL上清于離心管,再取300uL上清于離心管。前者用于測(cè)試,后者備用。-80攝氏度凍存。注意:購(gòu)置的RIPA不宜反復(fù)凍融,需分裝-80攝氏度保存;PMSF為晶體狀,購(gòu)置后按照說(shuō)明書(shū)溶于異丙醇,分裝-80攝氏度保存三、蛋白上樣量定量采用BCA法測(cè)蛋白(BCAproteinassaykit,Prod號(hào)23225,詳見(jiàn)下載的網(wǎng)頁(yè),ThermoScientific):(一)器材和試劑準(zhǔn)備:1.5mL離心管、BCA測(cè)試試劑盒、提蛋白剩余的RIPA蛋白裂解液(二)步驟1、詳見(jiàn)BCAProteinAssayKit.pdf使用說(shuō)明
4、書(shū),配制溶液,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定蛋白濃度。(加好各試劑,混合于37攝氏度放置30分鐘)2、使用AmershamBiosciencesGeneQuantPro分光光度計(jì)的562nm測(cè)試,讀數(shù)三次,取平均值(ug/mL)四、SDS聚丙烯酰胺凝膠的配制(各濃度的配制見(jiàn)配方表)SDS-PAGE試劑配制1)30%丙烯酰胺溶液:丙烯酰胺(Acrylamide)29.0g 亞甲雙丙烯酰胺(Bis-Acrylamide)1.0g dddH2O,37℃溶解,定容至100ml,棕色瓶存于4℃。2)分離膠緩沖液1.5mol/LTris-Hcl(PH8.8)Tri
5、s18.15g1mol/LHCL調(diào)節(jié)PH(可以使用分析純級(jí)別的濃鹽酸,下同)dddH2O定容至100mL,4℃保存3)濃縮膠緩沖液1.0mol/LTris-Hcl(PH6.8):Tris12.1g1mol/LHCL調(diào)節(jié)PHdddH2O定容至100mL,4℃保存4)10%SDS溶液:SDS10.0gdddH2O定容至100ml,室溫保存5)10%過(guò)硫酸銨(AP):過(guò)硫酸銨0.1gdddH2O定容至1.0ml,4℃保存,要在一周內(nèi)使用,最好新鮮配制6)TEMED遮光保存,分裝于EP管凍存五、電泳(一)器材和試劑準(zhǔn)備:電泳儀、電磁鍋、浮板、離心機(jī)、1
6、.5mL離心管、Marker、5×上樣緩沖液(loadingbuffer)、生理鹽水、電泳液5×SDS-PAGELoadingBuffer配制方法(20mL體系總體積): DTT(DL-Dithiothreitol,二硫蘇糖醇)(0.1M)1.54gSDS(sodiumdodecylsulfate) 2.0g 1MTris-CL(pH6.8)8.0mL溶解后加入10mL甘油及少量溴酚藍(lán)定容至20mL(二)步驟1、電泳上樣體系總25uL(即每孔加25uL):(下表的列表示凝膠孔一個(gè)孔所加的試劑) Marker管(泳道)蛋白樣品管(泳道)空白管
7、(泳道)蛋白無(wú)?無(wú)5×loadingbuffer5uL5uL5uLMarker7uL無(wú)無(wú)生理鹽水13uL補(bǔ)齊至25uL20uL體系總體積25uL25uL25uLMarker條帶依次是170、130、95、72(red)、55、43、34、26、17、10(green)KD大小的梯度。蛋白樣品管的上樣量的計(jì)算:40ug(這個(gè)值不一定的,可以根據(jù)算出的體積來(lái)改變。比如超過(guò)20uL則需要減少上樣量。而且如果內(nèi)參不齊時(shí)也需要調(diào)整)除以依據(jù)分光光度計(jì)的讀數(shù)算出的蛋白濃度ug/mL(根據(jù)說(shuō)明書(shū)蛋白以1:20被稀釋?zhuān)?,再轉(zhuǎn)換成uL的單位??瞻坠艿脑O(shè)置是因?yàn)椋?/p>
8、當(dāng)?shù)鞍讟悠飞儆?個(gè)樣品時(shí),空出的孔需要加入物質(zhì),以免蛋白跑偏。2、根據(jù)上表加好各試劑后,于270攝氏度水浴5分鐘,離心,再上樣,倒入電泳液3、上層膠8