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1、白花蛇舌草乙醇提取物對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞株增殖和凋亡的影響高寶安，陳世雄，楊俊，黃驥，鄧紅艷【摘要】 目的探討白花蛇舌草乙醇提取物在體外對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞株增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制。方法采用MTT法測(cè)定不同濃度白花蛇舌草乙醇提取物對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響；Hoechst33258檢測(cè)白花蛇舌草乙醇提取物作用后細(xì)胞凋亡情況；流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物作用后的細(xì)胞周期和凋亡率；EM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。碘化丙啶（PI）購(gòu)于Pharmingin公司（晶美公司代理）。Hochest33258購(gòu)于Sigma公司。鼠抗人Bax、Bcl-2及β-actin單抗購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司。 1.2
2、細(xì)胞及其培養(yǎng) 肺腺癌細(xì)胞株A549購(gòu)于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，用含10％小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）的DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），在含5％CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25％胰蛋白酶消化傳代?！ ?.3MTT試驗(yàn) A549細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105ml-1，接種于96孔板，每孔100μl。分設(shè)對(duì)照組和不同濃度藥物組（5，10，20，40，80mg/ml），每孔設(shè)6復(fù)孔，分別培養(yǎng)1，2，3，4d；每孔加入5g/LMTT10μl，繼續(xù)孵育4h，每孔加入200μl二甲基亞砜（DMSO）終止，振蕩15min，450型ELISA-Re
3、ader酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）570nm主波長(zhǎng)，630nm副波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度。以對(duì)照組細(xì)胞活力為100％，按公式計(jì)算不同濃度白花蛇舌草乙醇提取物對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制率：細(xì)胞抑制率（%）＝(1－藥物組吸光度/對(duì)照組吸光度)×100％ 1.4Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇40mg/ml的白花蛇舌草乙醇提取物作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度。將干凈無(wú)菌的蓋玻片置于六孔板內(nèi)，接種細(xì)胞過(guò)夜。當(dāng)50％～80％滿時(shí)，加入白花蛇舌草乙醇提取物作用12，24，36，48h后，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5ml的固定液，固定10min。然后去固定液，用PBS洗兩次，3min/次，
4、吸盡液體，加入0.5mlHoechst33258染色液（1mg/ml），染色5min，晃動(dòng)數(shù)次，封片，熒光顯微鏡下觀察?！ ?.5流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和凋亡率 將A549細(xì)胞接種于六孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至75％融合左右，對(duì)照組加入DMEM培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入白花蛇舌草乙醇提取物（40mg/ml），作用0，12，24，36，48h后，胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌后，80％冰乙醇固定，－20℃過(guò)夜。檢測(cè)前PBS沖洗細(xì)胞1次，調(diào)整細(xì)胞濃度為106ml-1，加入含RnaseA（終濃度為0.25mg/ml）的碘化丙啶（PI）染色液（終濃度為5μg/ml）中，室溫避光染色30min，流式細(xì)胞儀（購(gòu)自B
5、echmanDickson公司）檢測(cè)，每組重復(fù)3次，CellQuest及Motift軟件分析SubG1峰和細(xì)胞周期。1.6蛋白免疫印跡試驗(yàn)（TT結(jié)果顯示，不同濃度的白花蛇舌草乙醇提取物均能抑制肺腺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，藥物作用效果具有較明顯的的時(shí)效和量效關(guān)系（見(jiàn)圖1）。經(jīng)觀察，選擇40mg/ml的藥物濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物劑量。2.2Hoechst33258染色檢測(cè)結(jié)果用Hoechst33258對(duì)白花蛇舌草乙醇提取物作用A549細(xì)胞36h后的細(xì)胞核進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組活細(xì)胞所發(fā)熒光較弱，較均勻；經(jīng)白花蛇舌草乙醇提取物作用36h后發(fā)生凋亡的A549細(xì)胞核明顯變小，并可
6、見(jiàn)致密強(qiáng)熒光，可見(jiàn)凋亡小體。見(jiàn)圖2?！ ?.3白花蛇舌草乙醇提取物對(duì)A549細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的影響 40mg/ml的白花蛇舌草乙醇提取物作用于A549細(xì)胞12，24，36，48h，通過(guò)亞G1峰檢測(cè)其凋亡率分別為（5.72±0.98）%，（7.10±2.08）%，（19.89±4.25）%，（32.55±6.51）%，與對(duì)照組細(xì)胞凋亡率相比，差異有顯著性（P均0.05）。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，40mg/ml的白花蛇舌草乙醇提取物作用A549細(xì)胞后，G1～G0期細(xì)胞百分比逐漸增高，從0h的（36.34±5.15）%，升高到48h的（64.94±7.56）%。結(jié)果見(jiàn)表1和圖3。表140m
7、g/ml白花蛇舌草乙醇提取物對(duì)A549細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率的影響（略） 2.4〕.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：433. 〔3〕趙浩如，李瑞，林以寧，等.白花蛇舌草不同提取工藝對(duì)抗腫瘤活性的影響〔J〕.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，33（6）：510. 〔4〕TammI，SchrieverF，DorkenB.Apoptosis:implicationsofbasicresearchforclinicaloncology〔J
