靈芝孢子對體外培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響

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1、靈芝孢子對體外培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響　　卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤之一，其治療以手術(shù)和化療為主。隨著治療手段的提高，患者的生存率和生活質(zhì)量也得到了一定程度的提高，但由于治療效果仍不十分理想，其病死率仍居婦科惡性腫瘤之首。因此尋求有效的治療方法仍然是卵巢癌的研究焦點。目前中藥作為卵巢癌輔助治療手段之一越來越受到重視。靈芝孢子在我國及其他亞洲國家已被公認(rèn)為治療多種疾病的中藥，并且已有大量應(yīng)用靈芝孢子治療各種腫瘤的研究報道［1－3］。本研究觀察了在不同藥物濃度下靈芝孢子對體外培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響，探討其對人卵

2、巢癌OV2008細(xì)胞生長抑制作用的機(jī)制，為其在卵巢癌的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)?！　?材料與方法　　1．1材料　　1．1．1儀器:NU2600E型CO2培養(yǎng)箱(ESBEScientif-icMC017A1C);超凈工作臺(MicrozonecoinporationF40BX/SPZ41);EL340酶標(biāo)儀(Bio．TEKINSTＲU-MENTSINS);倒置相差電子顯微鏡(ZEISSAXIOVEＲT25);熒光顯微鏡(NIKONTE2000-U);水浴箱(FisherScientificISOTEMP210);離心機(jī)(Shel

3、tonScientificCENTＲACL2);流式細(xì)胞儀(BDFACScali-ber:BDBIOsciencesE97600092)?！　?．1．2試劑與藥品:靈芝孢子粉由加拿大energene天然藥品有限公司提供，批號為083668。I1640培養(yǎng)基為FisherScientific公司產(chǎn)品、新生小牛血清、Hoechst33258為Invitrogen公司產(chǎn)品;青鏈霉素(含10000U青霉素及10000微克鏈霉素)為Invitrogen公司產(chǎn)品，批號為15140-148。臺盼蘭(Trypanblue)EMD公司產(chǎn)品，

4、批號EM8721-0;Trypsin、碘化丙啶(PI)、核糖核酸酶A(ＲnaseA)多聚甲醛溶液(Paraformaldehyde)、為Sigma公司產(chǎn)品;Bax、bcl-2、cleaved-casepase3抗體為cellsig-nalingTechnology公司產(chǎn)品;p27Kip1抗體為BDBio-science產(chǎn)品?？故蠹翱雇枚官徲贔isherScientific公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒及感光膠片為GE公司產(chǎn)品?！　?．2方法　　1．2．1細(xì)胞及培養(yǎng):人卵巢癌細(xì)胞系OV2008為完成該實驗的加拿大york大學(xué)生

5、命科學(xué)系chunpeng實驗室保存。用含10%胎牛血清(Sigma公司產(chǎn)品)、1%青霉素鏈霉素(Invitrogen公司產(chǎn)品)的ＲPMI1640培養(yǎng)基(Thermo公司產(chǎn)品)，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)?！　?．2．2靈芝孢子粉工作液配制:靈芝孢子粉由加拿大energene天然藥品有限公司提供。將靈芝孢子粉500mg溶于10mlDD-H2O中配制成50mg/ml的靈芝孢子液，高溫滅菌、促溶，靜置或離心后取上清，用0．20μm微孔濾膜過濾器過濾除菌，即刻用于實驗或作為儲存液密封置于4℃冰箱，保存2周，再次使用前7

6、0℃孵育10min。　　1．2．3illipore公司產(chǎn)品)上，用含有50g/L去脂奶粉的TBST(10mmol/LTris-Cl(pH值8．0)，150mmol/LNaCl，0．05%Tin。HＲP標(biāo)記的抗兔IgG二抗孵育1h;T-BST漂洗3次，應(yīng)用ECL-plus期細(xì)胞數(shù)目較少，且G2/M細(xì)胞隨作用時間延長而減少，S期細(xì)胞數(shù)目隨作用時間無明顯改變。見圖3?！　　　?．3靈芝孢子誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡為明確靈芝孢子是否通過凋亡途徑致卵巢癌細(xì)胞死亡，采用Hoechst-33258染色方法檢測卵巢癌細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示靈芝孢

7、子可致卵巢癌細(xì)胞凋亡，并呈劑量依賴性。熒光顯微鏡觀察到典型凋亡細(xì)胞染色后表現(xiàn)為細(xì)胞核縮小，染色質(zhì)濃縮，藥物濃度越大凋亡細(xì)胞越多。見圖4?！　　　?靈芝孢子對卵巢癌細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)靈芝孢子對bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響:為明確靈芝孢子引起卵巢癌細(xì)胞凋亡的信號通道，利用靈芝孢子處理后細(xì)胞的蛋白質(zhì)測定了bcl-2和Bax的表達(dá)情況。結(jié)果表明隨靈芝孢子濃度增加bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，而bax蛋白水平升高靈芝孢子對P27蛋白表達(dá)的影響:為了闡明靈芝孢子對卵巢癌細(xì)胞細(xì)胞周期影響的機(jī)制，采用g/ml。通過DNA特異性結(jié)合的熒光

8、染料Hoechst33258染色觀察到靈芝孢子作用于卵巢癌細(xì)胞后出現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞染色質(zhì)聚集改變。提示靈芝孢子可以通過周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡途徑發(fā)揮增殖抑制作用?！　§`芝孢子對腫瘤細(xì)胞周期的影響有不同的報道，Zhu等［2］的研究表明靈芝孢子的酒精提取物可以使宮頸癌HeLa細(xì)胞停滯于G1/S期，Hu等［8］在