cd158a表達(dá)調(diào)節(jié)胃癌患者ctl細(xì)胞功能的體外研究

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1、CD158a表達(dá)調(diào)節(jié)胃癌患者CTL細(xì)胞功能的體外研究：劉振華,陳曉耕，林孟波，黃毅【摘要】　　目的研究CD158a表達(dá)對(duì)胃癌CTL細(xì)胞體外功能的影響。方法利用免疫磁珠法分選培養(yǎng)表達(dá)與不表達(dá)CD158a的兩型細(xì)胞，MTT法測(cè)定其體外殺傷胃癌MNK45細(xì)胞的活性，Elispot試驗(yàn)檢測(cè)其分泌細(xì)胞因子的變化，RTPCR方法檢測(cè)其mRNA的表達(dá)差異及CD158a受體激發(fā)后(Trigerring)的細(xì)胞毒T細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果CD158a+CTL幾乎不殺傷人胃癌MNK45細(xì)胞，但阻斷相應(yīng)CD158a分子或靶細(xì)胞MHC1分子后

2、，殺傷活性得到一定程度恢復(fù)。CD158a-CTL以分泌γIFN為主，參與Th1反應(yīng)，而CD158a+CTL主要分泌IL4，可能介導(dǎo)Th2反應(yīng)。3例胃癌患者的CD158a+CTL細(xì)胞均可擴(kuò)增出300bp的P58.2cDNA特征性條帶。CD158a分子激發(fā)后，CD158a+CTL凋亡細(xì)胞具有顯著的形態(tài)學(xué)特征，DNA電泳有典型的“l(fā)adder”梯型條帶。結(jié)論CD158a表達(dá)抑制胃癌CTL體外殺瘤活性，影響其細(xì)胞因子的分泌，并在激發(fā)后誘導(dǎo)CTL細(xì)胞凋亡?！娟P(guān)鍵詞】胃腫瘤T淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒性殺傷細(xì)胞天然受休細(xì)胞表面　　近年來

3、，殺傷細(xì)胞抑制受體(killerinhibitionreceptor,KIR)的發(fā)現(xiàn)豐富了學(xué)者對(duì)腫瘤免疫調(diào)節(jié)的認(rèn)識(shí)。KIR主要表達(dá)于人自然殺傷(NK)細(xì)胞和某些T淋巴細(xì)胞，其中的CD158a分子屬于P58.1超家族，相對(duì)應(yīng)人白細(xì)胞抗原(HLA)配基為HLACHCⅠ)結(jié)合，傳遞負(fù)性調(diào)控信號(hào)，在機(jī)體抗腫瘤免疫及移植排斥中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。Gati等研究表明，于腎癌腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)表面KIR分子可下調(diào)CTL殺瘤效能，認(rèn)為KIR表達(dá)是CD8+CTL免疫無能的主要機(jī)制，揭示CD158a分子

4、有助于免疫逃逸[1]。本研究旨在揭示CD158a表達(dá)對(duì)胃癌CTL細(xì)胞體外功能的影響。　　1材料和方法　　1.1胃癌患者T細(xì)胞表達(dá)CD158a測(cè)定參照文獻(xiàn)[2]的方法，分離3例患者T細(xì)胞及誘導(dǎo)CTL細(xì)胞，采用直接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)，分別標(biāo)記抗體FITCDX27(antiCD158a，IgG1，美國Immunotech公司)，設(shè)同型、同標(biāo)記鼠抗人單抗作空白對(duì)照。檢測(cè)3例患者的分離新鮮T細(xì)胞及其CTL細(xì)胞表達(dá)CD158a的情況?！　?.2CD158a+CTL與CD158a-CTL的分選培養(yǎng)利用有限稀釋克隆技術(shù)，當(dāng)陽性孔克

5、隆細(xì)胞生長(zhǎng)到一定數(shù)量級(jí)(每孔105時(shí)，利用熒光標(biāo)記單抗結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表型，標(biāo)記后作相應(yīng)培養(yǎng)、擴(kuò)增，AIMV培養(yǎng)基含rIL2800IU/mL(北京瑞得一合通公司)。每3～5d換液1次，每周添加1次抗原及維持量的rIL2(400IU/mL)以維持CTL細(xì)胞活性。免疫磁珠法分選兩型細(xì)胞，具體操作參見說明書(美國Stemcells公司)?！　?.3CD158a+CTL與CD158a-CTL細(xì)胞的體外殺瘤活性人胃癌MNK45細(xì)胞由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院張學(xué)光教授惠贈(zèng)。體外殺瘤活性檢測(cè)取效∶靶比(10∶1)，MTT法測(cè)定[3

6、]，λ=490nm，計(jì)算公式為：　　殺傷活性(%)=(D實(shí)驗(yàn)孔-D陰性對(duì)照)/D無殺傷對(duì)照×100%　　每組設(shè)三復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)中，只有靶細(xì)胞孔為無殺傷對(duì)照，效應(yīng)細(xì)胞孔為陰性對(duì)照孔。殺傷阻斷試驗(yàn)選用單抗為抗HLAA、B、C單抗及抗CD158a單抗(即DX27，美國Pharmingen公司)[4]。均以5μg/mL作用于相應(yīng)細(xì)胞，37℃孵育2h，以PBS洗去未結(jié)合抗體，然后再測(cè)定相應(yīng)體外殺傷活性。　　1.4RTPCR檢測(cè)CD158a分子mRNA表達(dá)應(yīng)用Trizol試劑法提取CD158a+CTL細(xì)胞總RNA，RTPCR應(yīng)

7、用瑞士羅氏公司(Roche)生產(chǎn)的TitanRTPCR試劑盒。KIR引物的設(shè)計(jì)與合成參照文獻(xiàn)[5]，委托上海生工公司合成?！　IR(402bp)：　　上游：5’TTCCCTCCTGGCCCACCCA3’　　下游：5’TCCCTGGATAGATGGTACA3’　　βactin(548bp)：　　上游：5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3’　　下游：5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTC3’　　1.5CD158a+CTL與CD158a-CTL分泌γIFN及IL4的檢測(cè)采用E

8、lispot試驗(yàn)[6],略作修改。主要試劑均購自深圳晶美生物工程公司?？功锚睮FN或抗人IL4單抗15μg/mL包被96孔酶聯(lián)檢測(cè)板(Nunc)，4℃過夜;洗板，CD158a+CTL與CD158a-CTL以含10mmol/LHEPES的RPMI1640液配成1×106mL-1，每孔加100μL細(xì)胞懸液。加入自體DC(DC∶T為1∶10)100