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1、白藜蘆醇誘導(dǎo)大鼠原代脂肪細(xì)胞凋亡及機(jī)制：陳思凡，周妮曼，鄭琳，柯梁汝，單智銘，馮翔【摘要】【目的】探討白藜蘆醇(Res)對(duì)大鼠原代脂肪細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制?！痉椒ā颗囵B(yǎng)大鼠原代脂肪細(xì)胞，添加不同劑量的Res干預(yù)，用Hoechst33258染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài);用DNALadder實(shí)驗(yàn)觀察DNA斷裂的條帶;檢測(cè)各組培養(yǎng)基和細(xì)胞內(nèi)的乳酸脫氫酶(LDH)含量，計(jì)算LDH漏出率;用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率;ethods】Ratprimaryadipocytesorphologicaltransformat
2、ioninedicroscope.DNALadderassaycellapoptosis.TheLDHcontentinmediumandcellseasuredtocalculatetheLDHleakingratio.Thenumberofapoptoticcellsetry.Theexpressionofsilentinformationregulator1(Sirt1)，CytochromeC，CleavedCaspase9，CleavedCaspase3inedusingSO溶解，配置成80mmol/L
3、的儲(chǔ)備液，DMSO在培養(yǎng)基的終濃度低于0.1%)，DMSO，Ⅰ型膠原酶，Hoechst33258，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;高糖DMEM培養(yǎng)基，新生牛血清，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;DNAmarker，DNALadder檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海Beyotime公司;LDH檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所;細(xì)胞凋亡測(cè)定試劑盒，購(gòu)自美國(guó)BD公司;兔抗Sirt1單克隆抗體，購(gòu)自英國(guó)abcam公司;兔抗CytochromeC、CleavedCaspase9、CleavedCaspase3單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)CST公司;兔抗
4、GAPDH單克隆抗體，購(gòu)自武漢Boster公司;細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒，BCA試劑盒，HRP標(biāo)記的抗兔二抗，購(gòu)自上海Beyotime公司?！ ?.2方法 1.2.1大鼠原代脂肪細(xì)胞的培養(yǎng) 雄性SD大鼠10只，體質(zhì)量160～180g，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。原代脂肪細(xì)胞分離與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程：取大鼠1只，麻醉處死后無(wú)菌分離附睪脂肪組織，以眼科剪剪200～300次，剪碎至1mm3以下，用1.5g/L的Ⅰ型膠原酶消化細(xì)胞，放入水浴搖床，100～120r/min，37℃水浴消化約40min，100目的網(wǎng)過(guò)濾，靜置于離心管約
5、5min，脂肪細(xì)胞自然上浮，將成熟的脂肪細(xì)胞用培養(yǎng)基重復(fù)洗2次，在培養(yǎng)管中加入無(wú)酚紅的DMEM培養(yǎng)基(100mL/L新生牛血清、100IU/mL青霉素、100IU/mL鏈霉素)，觀察細(xì)胞狀況。取3只SD大鼠，按以上方法分離培養(yǎng)原代脂肪細(xì)胞，按照下面的實(shí)驗(yàn)方法添加不同劑量的Res，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、95%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱里進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù)試驗(yàn)。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次?！ ?.2.2Hoechst33258染色 細(xì)胞用20、40、80μmol/L的Res作用12h，對(duì)照組添加相等量的DMSO作為參照，藥物
6、處理完畢后用PBS洗滌2次，用甲醇/冰醋酸(3：1)于4℃固定10min，洗滌后用Hoechst33258(濃度為5mg/L)避光染色15min。用PBS洗滌1次。進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取約6000個(gè)細(xì)胞均勻涂在載玻片上，用甘油封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照(激發(fā)波長(zhǎng)340nm，發(fā)射波長(zhǎng)420nm)。 1.2.3DNALadder實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞經(jīng)過(guò)20、40、80μmol/L的Res干預(yù)6h或12h后，按照DNALadder試劑盒說(shuō)明書，利用離心柱抽提法，抽提并純化各組細(xì)胞的DNA，取20?滋L的DNA樣品，加6×DN
7、A上樣緩沖液(體積分?jǐn)?shù)30%甘油，0.25%溴酚藍(lán))，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的瓊脂糖凝膠(含0.5?滋g/mL溴化乙錠)中進(jìn)行電泳(40V，電泳約3h)，染料泳動(dòng)至2/3處。在凝膠成像分析儀上對(duì)凝膠進(jìn)行拍照，觀察DNALadder的形成。 1.2.4乳酸脫氫酶含量的檢測(cè) 收集各組的培養(yǎng)基和細(xì)胞，細(xì)胞在PBS中重懸，通過(guò)超聲裂解細(xì)胞，按照LDH檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)并計(jì)算各組培養(yǎng)基和細(xì)胞內(nèi)的乳酸脫氫酶(lacticdehydrogenase，LDH)含量。LDH漏出率(%)=c培養(yǎng)基(LDH)/(c培養(yǎng)基(LDH)
8、+c細(xì)胞內(nèi)(LDH))?！ ?.2.5流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞經(jīng)20、40、80μmol/L的Res干預(yù)12h后，收集各組細(xì)胞，按照細(xì)胞凋亡率測(cè)定試劑盒的方法，分別添加AnnexinV和7-AAD，處理后在流式細(xì)胞儀上測(cè)定細(xì)胞凋亡率。 1.2.6CytochromeC、CleavedCaspase9、CleavedCaspase3的蛋白表達(dá) 用NP40裂解細(xì)胞
