大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化與成骨鑒定

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1、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化與成骨鑒定：李顯澎樊粵光劉建仁范海蛟江曉兵孫志剛曾建春陽建權(quán)【摘要】【目的】研究大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的分離純化和在誘導(dǎo)條件下的成骨能力?！痉椒ā咳PF級SD大鼠6只，采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，取傳至第3代的MSCs進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)和免疫組化鑒定；應(yīng)用含地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)傳代細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，檢測堿性磷酸酶（ALP）的活性和細(xì)胞礦化作用進(jìn)行成骨細(xì)胞鑒定?！窘Y(jié)果】全骨髓貼壁培養(yǎng)法能有效分離純化大鼠骨髓MSCs，MSCs在含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的低糖DMEM（L-DMEM）培養(yǎng)液中

2、生長性狀相對穩(wěn)定，增殖速度快；誘導(dǎo)條件下，細(xì)胞ALP活性明顯增高，并出現(xiàn)了礦化結(jié)節(jié)?！窘Y(jié)論】建立了一種體外分離純化、培養(yǎng)擴(kuò)增大鼠骨髓MSCs的方法，成骨能力肯定，為中藥蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供材料基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/病理學(xué)；細(xì)胞培養(yǎng)，體外的；組織工程　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）在體內(nèi)外誘導(dǎo)因子的作用下，可向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，具有很大的可塑性［1］，這使其在組織工程、細(xì)胞治療等方面成為研究的熱點(diǎn)［2］。為更好地將MSCs應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥、骨壞死、骨缺損，本實(shí)驗(yàn)通過體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法將MSCs從骨髓中分離純化，觀察MSC

3、s在體外的擴(kuò)增、鑒定，并誘導(dǎo)其定向成骨分化?，F(xiàn)報(bào)道如下?！　?材料與方法　　1.1動(dòng)物SD大鼠6只，SPF級，體質(zhì)量140~160g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號為：0025033?！　?.2主要試劑與儀器低糖DMEM（L-DMEM，美國Gibco公司，GNM31600）；兔抗大鼠CD34（BA0532）、CD44（BA0321）、CD54（BA0541）（武漢博士德公司）；高糖DMEM（Hyclone，SH30022.01B）；胎牛血清（Hyclone，SV30087.01）；胰蛋白酶（Hyclone，SV30042.01）；β-甘油磷酸鈉（美國Simga公司）；

4、地塞米松（美國Sigma公司）；D-hanks（美國Simga公司）；維生素C（美國Sigma公司）；生物素化抗生蛋白鏈菌素復(fù)合物（streptavidinbiotinplex，SABC）（SA1022）試劑盒（武漢博士德公司）；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）（AR1022）（武漢博士德公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。C02恒溫培養(yǎng)箱（SheldonManufactruing.Inc,modelNo:2323-2shellab，USA）；3k-15低溫離心機(jī)（美國Sigma）；DL-CJ-IF超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），MPS60倒置顯微

5、鏡（LeikaDMIRB）；超純水系統(tǒng)（MILLPORE,SAS67120MOISHEMA,France）　　1.3培養(yǎng)液配制完全培養(yǎng)液：低糖DMEM（含體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清，10g/L青霉素、鏈霉素）；誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液：高糖DMEM（含體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清，10g/L青霉素、鏈霉素）中加入β-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C，終濃度分別為10mmol／L、10-8mol／L、50μmol/L?！　?.4骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離［3-4］取健康成年SD大鼠（150g左右），1g/L新潔爾滅浸泡30min后，斷頸處死，碘伏消毒，體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒，鋪無菌單蓋住上身；無菌條件

6、下取雙側(cè)股骨、脛骨，除去骨表面附著的軟組織，用L-DMEM浸泡清洗;用彎鉗將兩端骨骺切除，顯露骨髓腔。用10mL注射器吸取L-DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，以沖出骨髓；輕輕吹打，制成單細(xì)胞懸液；1000r/min離心20min，離心后去上清，用完全培養(yǎng)液重懸，入培養(yǎng)瓶中，用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)?！　?.5骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)將上述所得細(xì)胞懸液接種于25mL塑料培養(yǎng)瓶中，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。于培養(yǎng)后的第3天更換培養(yǎng)液以更新細(xì)胞代謝環(huán)境。以后每3d換液1次，去除未貼壁的細(xì)胞，待細(xì)胞匯合約80％時(shí)，用2.5g/L胰蛋白酶+0.4g/L乙二胺四乙酸（EDTA）

7、消化，按1：2傳代培養(yǎng)?！　?.6大鼠骨髓MSCs的生長曲線測定取生長良好的第2、3代細(xì)胞（P2、P3），2.5g/L胰蛋白酶消化，1×104／mL接種于24孔板，每天各取3孔消化計(jì)數(shù)，每孔計(jì)數(shù)3次，連續(xù)7d。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，描繪生長曲線（圖1）?！　D1大鼠骨髓MSCs生長曲線（略）　　Figure1Groin；磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2min，共3次；滴加正常山羊血清，室溫10min，除去多余液體，滴加多克隆兔抗大鼠CD34、CD44、CD54，4℃過夜；