改良混合酶消化法培養(yǎng)大鼠主動脈平滑肌細胞

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1、改良混合酶消化法培養(yǎng)大鼠主動脈平滑肌細胞:李成武,李應續(xù),朱從麗,宋健【摘要】目的探討改良酶消化法培養(yǎng)大鼠主動脈平滑肌細胞(VSMC)的方法,為動脈粥樣硬化等血管硬化性疾病的發(fā)病機制和防治研究提供幫助。方法提取大鼠的胸主動脈,采用混合酶消化后,采用含10%FCSRPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。通過細胞計數(shù)觀察細胞增殖,倒置相差顯微鏡觀察血管平滑肌細胞的生物學性狀,免疫組織化學進行細胞鑒定。結果消化肌平滑肌細胞24h后貼壁,平均貼壁率為76%,第5d后細胞數(shù)迅速增加,至第11d形成單層時,光鏡下出現(xiàn)“峰谷”樣生長;傳代后,細胞的生長特性無改變,αS

2、MA免疫組化染色檢測,證實細胞是VSMC。結論改良后酶消化法能短時、高效地培養(yǎng)生物學特征穩(wěn)定的VSMC?!娟P鍵詞】酶消化法;平滑肌細胞;胸主動脈;SD大鼠ABSTRACT:ObjectiveToexplorethecultivationofratvascularsmoothmusclecells(VSMC)byenzymaticdispersionentofangioscleroticdiseases.MethodsThethoracicarterymediatelyremovedandcutintofinetissuepieces,thenix

3、edmedium.Afterdigestion,thecellsoothmusclecellsicroscope,andimmunohistochemicalmethodbermonolayeron11thday.A"thepeakvalley"typeofgroicroscope.Afterpassages,thegroationcellmunohistochemicaltesting.ConclusionTheimprovedenzymaticdispersionmethodforVSMCcanincreasethecellstabilit

4、yofbiologicalcharacteristicse.KEY0002Boster);胎牛血清(16000044,Gibco);FITC標記的羊抗鼠IgG免疫熒光二抗。1.2主要溶液①DHank's液(g/L):KCl0.4g,KH2PO40.06g,NaCl8g,NaHCO30.35g,Na2HPO40.0318g;②RPMI1640培養(yǎng)基(含10%FCS):培養(yǎng)粉1.04g,雙抗2ml,谷氨酰胺4ml,F(xiàn)CS10ml,加雙蒸水至100ml;③0.4%膠原酶;④0.1%彈性蛋白酶;⑤0.1%脫氧核糖核酸酶Ⅰ型。1.3原代培養(yǎng)①取雌性SD大

5、鼠(體質(zhì)量約180±20g)斷髓處死,活力碘進行皮毛消毒,無菌條件下快速分離胸主動脈,并置于DHank's平衡鹽液中;②冰上操作:DHank's洗滌3次,清除血管表面的脂肪和結締組織;眼科剪縱向剪開血管,用無菌棉簽擦血管內(nèi)膜2~3次;鐘表鑷剝離血管中膜內(nèi)2/3的平滑肌組織,并收集于不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基中;③棄去組織塊中的培養(yǎng)基,加入3倍組織塊體積的新鮮配制的酶混合液(含0.4%膠原酶、0.1%彈性蛋白酶和0.1%、0.1%脫氧核糖核酸酶Ⅰ型),37℃恒溫水平搖床中震蕩54rpm,消化30min后,每隔10min用吸管輕柔快速吹打一

6、次,鏡下觀察組織消化,消化約1.5h后,鏡下觀察約90%以上組織成細胞懸液。用含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化;④將酶混合物收集于離心管中,1000rpm×5min離心,棄去上清液;⑤細胞接種于含10%FCS,100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的無酚紅RPMI1640培養(yǎng)基中,調(diào)整密度約5×105/ml,在37℃,5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。①倒置相差顯微鏡下觀察平滑肌細胞的形態(tài)和生長特性。②免疫組織化學鑒定:傳一代時,取接種有細胞的無菌蓋玻片,4%多聚甲醛室溫下固定30min,PBS沖洗2~3遍后,置于30%H2O2純乙

7、醇(30%H2O2∶純乙醇=1∶50)溶液中室溫下浸泡30min。蒸餾水沖洗3次,PBS沖洗1次后,加α平滑肌肌動蛋白(αSMA1∶250)在37℃孵育2h;PBS沖洗,加FITC標記的羊抗鼠IgG免疫熒光二抗(1∶500)37℃避光孵育1h后,PBS沖洗,顯微鏡下,任取6個視野計數(shù),計數(shù)抗αSMA染色陽性細胞數(shù)(VSMC胞胞漿中出現(xiàn)細絲狀棕褐色免疫反應產(chǎn)物為陽性)和總細胞數(shù),計數(shù)陽性百分率的平均值為培養(yǎng)SVMC的純度。2結果2.1原代培養(yǎng)VSMC形態(tài)學觀察消化下來的細胞呈圓形或橢圓,培養(yǎng)24h后,細胞貼壁良好,76%的貼壁形態(tài)呈樹枝狀,4

8、8h后細胞開始伸展,呈梭形,但數(shù)量幾乎沒有改變。第5d后,進入對數(shù)增殖,大量細胞完全伸展,開始發(fā)生融合(圖1),形成典型的長梭狀。第11

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