檀香萜烯合成酶基因的克隆與序列分析

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1、檀香萜烯合成酶基因的克隆與序列分析作者：文海濤，趙紅英，林勵，邱賢秀【摘要】目的通過克隆技術(shù)獲得參與檀香揮發(fā)油形成的萜烯合成酶基因。方法利用CTABLiCl法提取檀香已結(jié)香心材總RNA，采用RTPCR技術(shù)克隆萜烯合成酶基因。結(jié)果克隆獲得了一個檀香萜烯合成酶基因，該基因編碼區(qū)全長1731bp，編碼576個氨基酸殘基。結(jié)論CTABLiCl法能提取較高質(zhì)量的檀香心材總RNA，克隆獲得的萜烯合成酶具有編碼區(qū)。【關(guān)鍵詞】檀香;萜烯合成酶;基因克隆;序列分析　Abstract:ObjectiveToclonetheterpenesynthasegenefromSantalumalbumL

2、.enttheheartalbumL.AndRTPCRployedtoclonetheterpenesynthasegeneatthesametime.ResultsOneterpenesynthasegeneconsistedof1731bpnuclEicacidSantalumalbumL.,inoacidresidues.ConclusionCTABLiCltreatmentcouldextracthighqualityRNAfromtheheartalbumL.,andtheclonedterpenesynthasegenehadtheopenreadingframe.

3、　　KeyalbumL.;terpenesynthase;genecloning;sequenceanalysis　　名貴中藥檀香為檀香科植物檀香(SantalumalbumL.)的樹干心材，為行氣溫中、開胃止痛之常用中藥[1]。檀香原產(chǎn)于印度、印度尼西亞等地，1962年華南植物園從印尼引種檀香并在廣東地區(qū)試種成功[2]。檀香在自然生長情況下需10年左右才能初步形成具有芳香氣味的心材(俗稱結(jié)香)，30年以上才能供藥用，檀香心材揮發(fā)油是其主要活性成分，已有研究表明檀香揮發(fā)油主要成分為萜烯類化合物，其中檀香醇等倍半萜烯類占揮發(fā)油總量的60%～80%[3]。　　目前國內(nèi)外對檀香研究的報道

4、主要集中于檀香栽培技術(shù)和檀香揮發(fā)油組分分析上[4]，而對檀香心材揮發(fā)油積累機理卻鮮見報道。鑒于此，本研究擬對參與檀香萜烯類化合物生物合成過程中的關(guān)鍵酶——萜烯合成酶基因進行克隆和分析。萜類物質(zhì)的前體異戊烯基焦磷酸在萜烯合成酶的作用下形成不同的萜類骨架，經(jīng)過不同修飾酶的作用后形成不同的萜類化合物，該酶基因的克隆將為闡明檀香揮發(fā)油積累的機理提供理論支持，同時也為利用基因工程手段培育檀香良種、縮短檀香生長年限以及提高檀香揮發(fā)油含量等方面研究奠定堅實的基礎(chǔ)?！　?材料與方法　　1.1材料和試劑　　1.1.1材料供試材料為廣東湛江南藥試驗場的已結(jié)香檀香(SantalumalbumL.)心材，

5、檀香樹由廣東省中藥研究所邱金裕研究員鑒定為檀香科植物檀香SantalumalbumL.。采用鉆孔取樣的方式收集已結(jié)香部分心材，裝入試管后迅速放入液氮罐速凍，取回后保存于-80℃冰箱?！　?.1.2試劑　　RNA提取試劑包括溶液Ⅰ與溶液Ⅱ，溶液Ⅰ:2%CTAB,2%PVPK30,2mol·L-1NaCl，100mmol·L-1TrisHCl(pH8.0)，25mmol·L-1EDTA(pH8.0)，0.5g·L-1亞精胺。溶液Ⅱ:0.5%SDS，1mol·L-1NaCl，10mmol·L-1TrisHCl(pH8.0)，1mmol·L-1EDTA(pH8.0)，2種試劑均用DE

6、PC水配制。反轉(zhuǎn)錄試劑盒：采用Takara公司的PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit。克隆試劑盒：采用北京天根生化科技有限公司的pGMT試劑盒。TaqDNA聚合酶、dNTP、DNAMarker、T4DNALigase、限制性內(nèi)切酶等均為Takara產(chǎn)品;引物合成和測序由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。其他試劑為國產(chǎn)分析純?！　?.2方法　　1.2.1檀香心材RNA提取　　參照Chang等[5]方法進行提取并稍加改良。改良之處為用三氯甲烷/異戊醇(24∶1)抽提兩次、用10mol·L-1LiCl沉淀過夜，其他不變?！　?.2.2反轉(zhuǎn)錄　　采

7、用Takara公司PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit反轉(zhuǎn)錄RNA成cDNA。步驟為：(1)在離心管中依次加入總RNA4μL，oligo(DT)1μL，dNTP(10mmol·L-1)1μL，加RNasefreein，迅速取出冰上放置3min;(3)按順序分別加入5×Buffer4μL，RNaseinhibitor0.5μL，RNasefreeeScriptRTase1μL，42℃保溫1h，70℃滅活15min。于-20℃保存?zhèn)?/p>