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1、不同培養(yǎng)基成分對(duì)金鐵鎖愈傷組織生長(zhǎng)及皂苷含量積累的影響【關(guān)鍵詞】金鐵鎖；愈傷組織；皂苷含量；培養(yǎng)基成分 金鐵鎖PsammosileunicoidesS固體培養(yǎng)基（2,4-D0.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+KT0.1m·L-1+3%蔗糖+0.8%瓊脂，pH5.8），(25±1)℃下暗培養(yǎng)。外植體接種6d左右，切口處開(kāi)始膨脹；10d左右開(kāi)始長(zhǎng)出乳白色愈傷組織；20d左右愈傷組織逐漸覆蓋外植體，在25d時(shí)挑選質(zhì)地松散、生長(zhǎng)良好的愈傷組織，稱重后繼代培養(yǎng)，25d后收獲稱重。 2.2金鐵鎖愈傷組織測(cè)量指標(biāo) 干重增量=最終收獲干重
2、－接種干重量 金鐵鎖皂苷產(chǎn)量=干重增量×金鐵鎖皂苷含量 鮮重稱量：從培養(yǎng)瓶中取出愈傷組織，用濾紙吸凈其表面水分后稱重。干重稱量：將收獲的愈傷組織置于50℃下干燥至恒重。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值?！ ?.3金鐵鎖皂苷含量測(cè)定 2.3.1金鐵鎖皂苷的提取將獲得的愈傷組織干燥粉碎并準(zhǔn)確稱取2.00g，加入20倍量80%乙醇超聲波（頻率：40kHz,功率：500in，過(guò)濾得醇提液，揮干試劑得醇提物。將此醇提物用適量水溶解，用正丁醇（4∶3∶3）萃取3次。正丁醇萃取液蒸發(fā)至干，用甲醇溶解并定容至10ml，得金鐵鎖皂苷提取液。 2.3.2金鐵鎖皂
3、苷含量的測(cè)定目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)金鐵鎖皂苷類成分的法定對(duì)照品，本實(shí)驗(yàn)選擇人參皂苷Re為對(duì)照品，采用香草醛-高氯酸比色法測(cè)定金鐵鎖總苷含量?！ ?duì)照品溶液的制備：精密稱取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品5mg，加甲醇10ml，振蕩，搖勻，待用?！ ?biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7ml人參皂苷Re對(duì)照液置于具塞試管中，水浴揮干試劑，加入5%香草醛-高氯酸溶液0.2ml和高氯酸0.8ml，65℃下水浴20min,立即用冰水冷卻至常溫，加入5ml冰醋酸，搖勻靜置后于λ=540nm下測(cè)定吸光度，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度縱坐
4、標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以此方法得回歸方程為：A=1.6283C-0.0023，r=0.9991?！ 〗痂F鎖皂苷含量測(cè)定：精取金鐵鎖皂苷提取液0.5ml，置于具塞試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線操作。用回歸方程計(jì)算金鐵鎖皂苷的含量，折算成愈傷組織中的含量和每升培養(yǎng)基的產(chǎn)量。 3.3氮源對(duì)金鐵鎖愈傷組織生長(zhǎng)和皂苷含量積累的影響由表2可知，KNO3與NH4NO3混合添加的時(shí)候，干重增量達(dá)到最高，皂苷含量積累也呈現(xiàn)較優(yōu)狀態(tài)。單獨(dú)加KNO3作用效果不明顯，單獨(dú)加NH4NO3作用效果較好并隨濃度增加而增大。綜合分析，混合氮源利于金鐵鎖愈傷組織生長(zhǎng)和皂苷的積累，KNO
5、3∶NH4NO3為（1.9∶1.65）g·L-1時(shí)效果最佳。表2氮源對(duì)金鐵鎖愈傷組織生長(zhǎng)及皂苷含量積累的影響（略） 3.4不同濃度磷酸鹽對(duì)金鐵鎖愈傷組織生長(zhǎng)及皂苷積累的影響由圖2可知，在KH2PO4小于1.00mmol·L-1時(shí)，金鐵鎖愈傷組織干重增量和金鐵鎖皂苷產(chǎn)量增加迅速，在1.00mmol·L-1時(shí)兩者達(dá)到最高，并隨著濃度增加而減小。因此，KH2PO4濃度為1mmol·L-1時(shí)為愈傷組織生長(zhǎng)和金鐵鎖皂苷合成的最佳濃度?！ ?.5鈣鹽對(duì)金鐵鎖愈傷組織生長(zhǎng)及皂苷積累的影響由圖3可知，愈傷組織干重增量隨著CaCl2濃度的增加而增大，在濃
6、度為4.5mmol·L-1時(shí)達(dá)到最大，大于4.5mmol·L-1時(shí)隨著濃度增加而減少。皂苷量在CaCl2濃度為3mmol·L-1之前增加迅速，在3～4.5mmol·L-1時(shí)相差不大，均處于較優(yōu)狀態(tài)，大于4.5mmol·L-1時(shí)隨濃度增加而減少。綜合考慮，CaCl2濃度為4.5mmol·L-1時(shí)為最佳濃度?！ ?討論 培養(yǎng)基成分對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的積累具有重要影響。碳源是細(xì)胞生長(zhǎng)的能量及構(gòu)成細(xì)胞骨架的重要成分，培養(yǎng)基中糖類不僅起到碳源作用，還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，其種類及濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的積累影響顯著［7］。研究表明
7、，金鐵鎖愈傷組織培養(yǎng)中蔗糖為最佳碳源，其中4%的蔗糖濃度最有利于細(xì)胞生長(zhǎng)及皂苷物質(zhì)的積累。同等條件下，蔗糖培養(yǎng)的愈傷組織干重增量及皂苷產(chǎn)量均明顯高于葡萄糖和麥芽糖，可能是蔗糖作為兩分子糖比單一葡萄糖作用要更為全面。同時(shí)發(fā)現(xiàn)蔗糖和白砂糖的作用效果較為相似，進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)開(kāi)發(fā)金鐵鎖時(shí)可選用白砂糖為碳源，以降低生產(chǎn)成本。氮是細(xì)胞核酸及生物體內(nèi)酶的重要組成成分，主要以氨態(tài)氮（NH4+）和硝態(tài)氮（NO3-）兩種形式存在，在植物體內(nèi)先轉(zhuǎn)化為氨基酸在轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)后被植物吸收利用。其種類及濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及次生產(chǎn)物合成具有顯著效果［8］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，單
8、獨(dú)使用NH4NO3或兩者混合使用效果均優(yōu)于單獨(dú)使用KNO3，說(shuō)明混合氮源利于金鐵鎖愈傷組織細(xì)胞生長(zhǎng)及皂苷產(chǎn)物的合成，KNO3∶NH4NO3的最優(yōu)質(zhì)量比值為1.9∶1.65g·L-1。磷元素在生
