慢病毒載體介導(dǎo)半乳凝素3shrna沉默基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的影響

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1、慢病毒載體介導(dǎo)半乳凝素3shRNA沉默基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的影響：王明棟，王洪，馬文斌，史彥芳，王任直【摘要】目的:構(gòu)建干擾半乳凝素3（Galectin3）的重組U6慢病毒質(zhì)粒，體外評(píng)價(jià)和觀察內(nèi)源性小RNA干擾效果及對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響.方法:根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)合成短發(fā)夾DNA，用于體內(nèi)轉(zhuǎn)錄合成干擾Galectin3編碼序列的發(fā)夾RNA.連接，篩選，酶切，鑒定pGCLGFP/U6Gal3shRNA1；以含無(wú)關(guān)序列發(fā)夾結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體為對(duì)照，感染乳腺癌細(xì)胞系，采用RTPCR和TT法和流式細(xì)胞檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的干擾情況.結(jié)果:測(cè)序證實(shí)重組質(zhì)粒

2、構(gòu)建成功，體外試驗(yàn)表明，Galectin3的mRNA和蛋白表達(dá)均一致降低，轉(zhuǎn)染組為（0.028%），陰性對(duì)照組為（0.617%），空白對(duì)照組為（0.992%），轉(zhuǎn)染組mRNA干擾效率達(dá)95%（P<0.05）；Galectin3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）.MTT檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)染組為（0.40±3.69）%，陰性對(duì)照組（0.71±0.16）%；轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）.細(xì)胞凋亡百分率為68.78%.結(jié)論:慢病毒介導(dǎo)的Galectin3shRNA成功在體外敲減了腫瘤

3、細(xì)胞的目的蛋白，影響了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展.【關(guān)鍵詞】慢病毒載體；半乳糖凝集素3；shRNA；基因沉默　　0引言　　半乳凝素3（Galectin3），是一種近年發(fā)現(xiàn)的所有脊椎動(dòng)物中結(jié)構(gòu)特殊、僅有的嵌合型，有兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，由單一LGALS3基因編碼［1-2］.在甲狀腺、乳腺、垂體腺等腫瘤中表達(dá)，具有多效性生物功能，如細(xì)胞黏附、抑制凋亡、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，premRNA等［3-4］.在侵襲性垂體泌乳素腺瘤胞漿內(nèi)蛋白和mRNA高表達(dá)，結(jié)合核分裂相，對(duì)判斷侵襲性和預(yù)后方面有一定作用［5-6］.目前將Galectin3基因體外敲減（konckdoallinterfere

4、nceRNAs,siRNAs)基因?qū)?，但?xì)胞存在著抵抗性.本研究旨在通過(guò)對(duì)Galectin3的RNAi重組含U6啟動(dòng)子慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定，體外觀察和評(píng)價(jià)內(nèi)源性小RNA對(duì)Galectin3基因及腫瘤細(xì)胞凋亡、增殖等的影響，為探索侵襲性腫瘤的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).　　1材料和方法　　1.1材料人乳腺癌細(xì)胞系MCF7由本實(shí)驗(yàn)室保存.DMEM培養(yǎng)基(DulbccosModifiedEagleedium)和新生小牛血清(美國(guó)Gibco公司)；慢病毒（上海吉?jiǎng)P基因生物技術(shù)有限公司)；質(zhì)粒提取試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒，限制性內(nèi)切酶：T4DNA連接酶、大腸桿菌

5、DH5α，Taq酶，dNTPMix(大連寶生生物有限公司)；Galectin3試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；山羊抗人Gal3多克隆抗體(美國(guó)SantaCruz公司)；辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)兔抗羊IgG抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司)；甘油醛3磷酸脫氫酶(上海邦成生物技術(shù)有限公司)；化學(xué)發(fā)光試劑盒、四甲基偶氮唑鹽（MTT），二甲亞砜（DMSO）（美國(guó)SantaCruz公司）；總RNA抽提Trizol，SDS硝酸纖維素膜（北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司）；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Fermentas公司）；相差倒置熒光顯微鏡（日本Olympaic公司）；定量PC

6、R儀(RG3000)（美國(guó)Biochem公司）；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國(guó)BioRad公司）；測(cè)序引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成.凝膠成像儀（美國(guó)GelDoc1000型BioRad）攝像分析,酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)產(chǎn)DG5031型），紫外線分光光度儀（日本UV240，Shimadzu公司），其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純.　　1.2方法　　1.2.1構(gòu)建攜帶特異shRNA編碼序列的RNAi質(zhì)粒根據(jù)人Galectin3基因序列(GenBankNo.NM_002306)mRNA的第653位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成caGGAGAGTCATTGTTTGCAA，G/C含量為42

7、.10%，病毒載體構(gòu)建框架序列為5′TcaGGAGAGTCATTGTTTGCAATTCAAGAGATTGCAAACAATGACTCTCCtgTTTTTTC3,5′TCGAGAAAAAAcaGGAGAGTCATTGTTTG　CAATCTCTTGAATTGCAAACAATGACTCTCCtgA3′,經(jīng)BLAST比對(duì)該序列與人其他基因無(wú)明顯同源性.經(jīng)雙鏈DNAoligo制備，15mL/L非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresisPAGE）凝膠檢測(cè)雙鏈形成效率，載體的線性化雙酶切，4℃12h連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化，陽(yáng)性克隆