人源抗肝癌單鏈抗體庫的構(gòu)建及初步鑒定

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1、人源抗肝癌單鏈抗體庫的構(gòu)建及初步鑒定【關(guān)鍵詞】噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)單鏈抗體肝癌　　0引言　　肝癌是我國常見的惡性腫瘤，目前治療措施是以肝切除術(shù)為主的綜合治療。但對于肝癌的早期診斷、治療療效尚不理想[1]。單鏈抗體(ScFv)是用基因工程方法將抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過一段連接肽(Linker)連接而成的重組蛋白,是保持了親本抗體抗原親和活性和特異性的最小功能性抗體片段[2]。構(gòu)建抗HCC噬菌體抗體庫和制備特異性單鏈抗體具有較大的基礎(chǔ)研究價值和廣闊的臨床應(yīng)用前景[3]。本實(shí)驗(yàn)就是利用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù),構(gòu)建了抗人肝癌單

2、鏈抗體基因噬菌體表面呈現(xiàn)文庫,并從中篩選到有抗原結(jié)合活性的抗體?！　?材料和方法　　1.1材料　　Trizol試劑、cDNA合成試劑盒和凝膠純化試劑盒購自Gibco公司，E.coliTG1、pCANTAB5E、M13KO7helperphage購自Promega公司，HRP/羊抗M13噬菌體抗體、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶SfiⅠ、NotⅠ購自Pharmacia公司，TaqDNA聚合酶購自Takara公司，淋巴細(xì)胞分離液購自上海生化試劑廠。SOBAG瓊脂板，2×YTAG，2×YTAK等試劑均自行配制。引物為10種VH和VL引

3、物混合物、與VH基因3′端和VL基因5′端序列互補(bǔ)的linkerPrimerMix、帶有SfiⅠ酶切位點(diǎn)的VH5′端引物和帶有NotⅠ酶切位點(diǎn)的VL3′端引物,引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[5],引物合成由北京Sunbiotech公司完成。肝癌細(xì)胞株SMMC7721由武漢大學(xué)典藏中心提供。30份肝癌患者的外周血標(biāo)本采自湖北省腫瘤醫(yī)院和武漢大學(xué)中南醫(yī)院普外科?！　?.2方法　　1.2.1從肝癌患者外周血中分離淋巴細(xì)胞無菌抽取30例肝癌患者外周血各5ml,于每管中加入3ml淋巴細(xì)胞分離液,采用密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞。　　1.2.2提取總RNA及c

4、DNA第一鏈的合成用Trizol試劑提取淋巴細(xì)胞中的總RNA。以oligo(dT)18為引物,用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA?！　?.2.3VH、VL基因的擴(kuò)增和鑒定分別以10種VH和VL混合物為引物,以cDNA第一鏈為模板,加入TaqDNA聚合酶，PCR擴(kuò)增全套VH、VL基因,反應(yīng)體積50μl,反應(yīng)條件為:94℃，1min；55℃，2min；72℃，2min；共30個循環(huán)。72℃延伸10min。循環(huán)結(jié)束后,以1.5%瓊脂糖凝膠回收并純化DNA。　　1.2.4ScFv基因的擴(kuò)增和鑒定以與VH基因3′端和VL基因5′端序列互補(bǔ)的l

5、inkerPrimerMix為引物,進(jìn)行重疊延伸反應(yīng),將VH、VL隨機(jī)拼接為ScFv。反應(yīng)體積50μl,反應(yīng)條件為94℃，1min；63℃，4min；共7個循環(huán)。用SfiⅠ、NotⅠ限制性內(nèi)切酶切割上述ScFvPCR產(chǎn)物,與相應(yīng)雙酶切的pCANTAB5E載體片段用T4DNA連接酶連接?！　?.2.5ScFv基因噬菌體呈現(xiàn)文庫的構(gòu)建取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliTG1,于SOBAG瓊脂板上過夜,篩選出轉(zhuǎn)化菌落,用2×YT－AG稀釋培養(yǎng)細(xì)菌懸液至A600nm=0.3,37℃震蕩培養(yǎng)，加入M13k07,離心后于2×YT－AK中過夜,離心

6、收集上清,即為抗人肝癌單鏈抗體庫。　　1.2.6噬菌體抗體庫的篩選在上清中加入PEG/NaCl，取含疊氮鈉的封閉液稀釋PEG沉淀的重組噬菌體,室溫下孵育,加入SMMC7721細(xì)胞抗原包被的錐形培養(yǎng)瓶中孵育。PBS、PBST洗瓶。將對數(shù)生長期的E.coliTG1加入上述免疫吸附后的培養(yǎng)瓶內(nèi)孵育。移至50ml細(xì)菌培養(yǎng)管中,再加入M13K07,37℃震蕩培養(yǎng),共4輪富集篩選?！　?.2.7噬菌體抗體庫抗體特異性測定將富集的重組菌涂平皿，從中挑選30株單克隆菌株。均加入輔助噬菌體超感染后,置于2×YTAG中過夜。接種適量SMMC7721細(xì)胞

7、于96孔培養(yǎng)板中,待細(xì)胞長滿孔底后,用0.125%戊二醛室溫固定10min,以3%BSA封閉非特異結(jié)合部位。每孔加上述噬菌體抗體50μl,經(jīng)0.05%T13抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng),37℃溫育1h,PBS洗板5次,ABTS顯色。以M13KO7為陰性對照,測定孔ELISAOD值為陰性孔2～3倍者為陽性?！　?.3噬菌體抗體庫的篩選經(jīng)對噬菌體抗體庫進(jìn)行4輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的富集篩選,測定噬菌體滴度,計(jì)算每一輪篩選后噬菌體的收獲率，噬菌體收獲率由第1輪的6.6×10-9%增到第4輪的1.7×10-6%,共增加了257倍?！　D1全套VH、VL基

8、因的擴(kuò)增（略）　　圖2ScFv基因的擴(kuò)增（略）　　2.4Panning篩選及抗原結(jié)合活性鑒定從第4輪篩選后得到的細(xì)菌集落中隨機(jī)挑選30個克隆,用ELISA測定上清液中噬菌體抗體與SMMC7721細(xì)胞結(jié)合活性。加入H2O2