全人源抗肝癌噬菌體單鏈抗體的篩選與鑒定

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1、全人源抗肝癌噬菌體單鏈抗體的篩選與鑒定：黃建,肖艷,童永清,郭鋒杰,周國華,李躍輝,胡錦躍,李官成【摘要】　　目的:構(gòu)建人源抗肝癌噬菌體單鏈抗體庫,從中篩選抗肝癌單鏈抗體（scFv）,并對其特異性進行鑒定。方法:采用體外致敏法和EBV轉(zhuǎn)化技術(shù)聯(lián)合噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建噬菌體抗體庫。對初級抗體庫進行親和富集及ELISA篩選,獲得的陽性克隆進行免疫組化鑒定并測序。結(jié)果:scFv基因與載體連接后得到庫容量為1.0×108的初級噬菌體抗體庫。對抗體庫進行3輪正負淘選和富集后,隨機挑取2798個克隆進行ELISA,發(fā)現(xiàn)3個克隆對HepG2呈強陽性反應(yīng),而與QSG7701等人正常細胞系呈弱陽性或不反應(yīng)。對

2、克隆SA3進行免疫細胞化學(xué)鑒定,結(jié)果與ELISA一致。免疫組織化學(xué)鑒定表明SA3與肝癌組織和肝組織陽性率的差別有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:構(gòu)建了庫容量達1×108的全人源抗肝癌噬菌體抗體庫。通過淘選富集、ELISA和免疫組織化學(xué)鑒定獲得特異性較強的噬菌體克隆,為肝癌的臨床診斷及導(dǎo)向治療奠定了基礎(chǔ)。【關(guān)鍵詞】EB病毒轉(zhuǎn)化噬菌體抗體庫肝腫瘤單鏈抗體　　[Abstract]AIM:Toconstructafullyhumanantihepatomasinglechainphageantibodylibrary,selecttheantihepatomascFvfromitandidentifyits

3、characteristics.METHODS:AfullyhumanscFvdisplayingphagelibrarymunizationandEBVtransformation.Thelibraryentandthenitacarcinomacellsedbyimmunohistochemistry.RESULTS:AfterscFvgenesbeingclonedintovectorFuse5andtransformedintoE.coliMC1061viaelectroporation,aphageantibodylibrarycontaining1.0×108TU(transd

4、ucedunit)entandtestingbyELISA,3phageantibodyclonesreactingmorestronglytoHepG2thanQSG7701munohistochemistryilartothoseofELISA.SA3reactedspecificallytohepatomacellsinmosthumanhepatomatissuesectionsbutinfeannormallivertissuesections.Thedistinctionofpositiveratesisofagreatstatisticalsignificance.CONCL

5、USION:AfullyhumanantihepatomascFvfusionphagelibraryhasbeenconstructed.ELISAandimmunohistochemistryresultsconformSA3specificallybindacarcinomacells.ThescFvfragmentagainsthepatomamaybefurtherdevelopedandappliedinclinicaldiagnosisandtherapyoflivercancer.　　[Keymortalization;phageantibodylibrary;hepato

6、ma;scFv　　肝癌是一種惡性程度極高的腫瘤,是我國和亞洲地區(qū)的常見病和多發(fā)病,病死率居惡性腫瘤的第3位[1]。肝癌90%以上為原發(fā)性,發(fā)病隱匿,發(fā)現(xiàn)時多數(shù)已處于中晚期,喪失了手術(shù)時機。目前的化療藥物由于缺乏肝癌細胞特異性而具有明顯的副作用。單克隆抗體（mAb）以其特異靶向性在放射免疫診斷和導(dǎo)向治療方面有較大的應(yīng)用價值,但其作為鼠源蛋白容易引起機體排斥反應(yīng),限制了它的臨床應(yīng)用。噬菌體抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)并發(fā)展成熟使獲得人源小分子抗體成為可能[2],它克服了mAb制備時效率低、雜交瘤體外培養(yǎng)不穩(wěn)定等缺點,便于篩選針對多種抗原的抗體,而且可以直接獲得抗體的基因序列,可以方便的通過基因工程手段進行改

7、造并大量生產(chǎn)。為提高篩選到特異性抗體的幾率,我們實驗室創(chuàng)立了體外致敏和EBV(EpsteinBarrvirus,EBV)轉(zhuǎn)化技術(shù)聯(lián)合噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建全人源噬菌體抗體庫的技術(shù)[3,4],并篩選到了特異性抗體。本研究我們即從利用此方法構(gòu)建的抗肝癌人源單鏈抗體庫中篩選出抗肝癌細胞單鏈抗體(scFv),為肝癌的診斷和治療奠定基礎(chǔ)?！　?材料和方法　　1.1材料絲狀噬菌體Fuse5,大腸桿菌菌株K91Kan,肝癌細