瘦素受體在實驗性多囊卵巢綜合征大鼠卵巢中的表達及

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1、瘦素受體在實驗性多囊卵巢綜合征大鼠卵巢中的表達及【摘要】目的研究來曲唑誘導建立多囊卵巢綜合征（PCOS）動物模型中卵巢組織瘦素受體（ObR）及其mRNA的表達，探討卵巢ObR變化與PCOS發(fā)病機制的關系。方法6周齡清潔級雌性SD大鼠45只，分為正常組、溶劑組和來曲唑組，各15只。正常組每日自由攝取食物和水；溶劑組每日給予1％羥甲基纖維素水溶液2mL/kg灌胃；來曲唑組以來曲唑0.5mg/kg灌胃。觀察大鼠體質量、動情周期、卵巢質量及其形態(tài)學改變，測定血清黃體生成素（LH）、睪酮（T）、胰島素（INS）、瘦素（LEP）及血糖（FG）水平，采用免疫組織化學和RealTi

2、meRTPCR方法檢測大鼠卵巢中ObR及其mRNA的相對表達，并對3組的各指標進行比較。結果來曲唑組大鼠體質量和卵巢質量指數(shù)升高，動情周期消失，卵巢體積增大，白膜增厚，HE染色可見較多囊狀擴張的卵泡且黃體數(shù)量明顯下降，血清T、LH、INS、LEP水平明顯升高（P<0.05）；卵巢ObR及其mRNA表達明顯增強（P<0.05）。結論來曲唑誘導建立的PCOS動物模型臨床表現(xiàn)與人類似；卵巢中ObR表達上調，可能是導致PCOS患者不排卵、生育力下降的原因之一。【關鍵詞】多囊卵巢綜合征；卵巢；瘦素；受體，肽；疾病模型，動物多囊卵巢綜合征(polycystic

3、ovarysyndrome，PCOS)是生育年齡婦女常見的內(nèi)分泌紊亂性疾病，以卵巢的功能紊亂為特征，常表現(xiàn)為不孕和肥胖，但其發(fā)病原因目前尚無定論。瘦素（leptin，LEP）是肥胖基因（ob基因）的表達產(chǎn)物，近年來的研究認為,LEP是營養(yǎng)與生殖之間的代謝信號，它在生殖方面有許多重要的調節(jié)作用[12]。研究還顯示，LEP存在于卵泡液中,且LEP受體（ObR）在人卵巢中幾種不同的細胞上也有表達，表明LEP能夠對性腺行使直接的作用[3]。筆者通過研究PCOS大鼠卵巢中ObR及其mRNA的表達情況，探討其與PCOS發(fā)病機制的關系，現(xiàn)報告如下。1材料和方法1.1PCOS動物

4、模型6周齡清潔級雌性SD大鼠，購自中國科學院上海實驗動物中心[許可證號：SCXX(滬)20070005]，平均體質量180g，二級動物房飼養(yǎng)，恒溫22℃，光照12h、黑暗12h交替，自由攝取食物和水。每日定時作陰道涂片檢查，選擇動情周期4～5d，連續(xù)2個正常動情周期的大鼠即開始用于實驗，共選出45只，分為正常組、溶劑組和來曲唑組，各15只。來曲唑組每日給予溶解在1％羥甲基纖維素水溶液（CMC）2mL/kg的來曲唑（芙瑞，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）0.5mg/kg灌胃，連續(xù)21d[45]；正常組每日自由攝取食物和水；溶劑組每日給予CMC2mL/kg灌胃。1.2大鼠體質

5、量及動情周期每日同一時間稱量大鼠體質量，同時進行陰道脫落細胞涂片，瑞氏染色后顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化，確定大鼠動情周期的情況。1.3大鼠血清中各項指標末次給來曲唑24h后，禁食8h，對所有大鼠進行下腔靜脈取血，采用放射免疫分析法測定大鼠血清黃體生成素（LH）、睪酮（T）及胰島素（INS）、LEP，試劑盒購自天津市協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別<10%和<15%。血糖（FG）測定采用葡萄糖氧化酶法，計算胰島素敏感指數(shù)(HomaIR)：HomaIR=FG×FINS/22.51.4卵巢標本采集及處理腹腔注射水合氯醛（0.3mL/100mg）麻醉

6、，打開腹腔，用去RNA酶處理過的機械取出雙側卵巢，去除表面脂肪組織并稱質量，一側用10%中性福爾馬林固定后石蠟包埋，留作光鏡下（HE染色）觀察卵巢形態(tài)學改變和免疫組織化學實驗；另一側存于-80℃冰箱，留作PCR檢測。1.5卵巢中ObR表達常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，厚4μm，共3套，分別用于HE染色、免疫組織化學染色及其對照試驗。按Elivision免疫組織化學方法進行操作，一抗為羊抗兔LEP受體抗體1∶100（北京中杉金橋生物技術有限公司），25℃過午；二抗50μL為羊抗兔（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）30min，DAB顯色3～5min，蘇木素復染1min。結

7、果判定參照文獻[6]，陽性為細胞內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒。按染色強度與陽性細胞百分數(shù)判定，>50%細胞著棕黃色為強陽性，評3分；<50%細胞著棕黃色或>50%著黃色為陽性，評2分；<50%細胞著黃色或均著淡黃色為弱陽性，評1分；不著色為陰性，評0分。每個標本觀察8個視野，雙盲法評估結果。1.6卵巢中ObRmRNA的表達1.6.1總RNA提取每100mg組織加1.0mL的Trizol溶液，充分研磨組織后，室溫靜置5min。加0.2mL氯仿用力振蕩15s，室溫靜置5min。4℃，12000r/min離心15min。吸上清，加入