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《畢赤酵母表達載體及宿主菌介紹》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、由于甲醇營養(yǎng)型酵母菌體內無天然質粒，所以攜帶外源基因的重組體必須整合于染色體中才能實現外源基因的表達。整合表達的優(yōu)點在于保持外源基因穩(wěn)定性并可產生多拷貝基因。典型的畢赤氏酵母表達載體含有醇氧化酶基因的調控序列，主要的結構包括：5’AOX1啟動子片段、多克隆位點(MCS)、轉錄終止和polyA形成基因序列(TT)、篩選標記(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作為一個能在大腸桿菌中繁殖擴增的穿梭質粒，它還有部分pBR322質?；駽OLE1序列。如果是分泌型表達載體，在多克隆位點的前面，外源基因的5’端和啟動子的3’端之間插人了分泌作用的信號肽
2、序列。在這個分泌信號的引導下，外源蛋白在內質網和高爾基體中經修飾和加工后能夠由胞內轉移至胞外，將成熟的蛋白質分泌到細胞外。為方便于操作，通常表達載體都是穿梭質粒。表達載體與酵母染色體有單交換和雙交換整合2種方式，單交換整合時，或插入A0X1位點，或插入his位點。有文獻報道，以his4作為整合位點時，染色體突變株與表達盒間存在基因轉換，偶而可使Laz表達盒丟失，故AOX1位點更好。一般認為，單交換轉化效率比雙交換效率高，且易得到多拷貝整合，其發(fā)生機制可能是重復單交換引起的。攜帶外源基因的表達載體可通過電穿孔、原生質體生成法或全細胞法轉化酵母細胞。甲醇酵
3、母轉化和大腸埃希氏菌轉化不同之處是前者較為復雜。對于大腸埃希氏菌而言，只要把重組表達載體導入細胞體內即可。因其載體上攜帶有自身復制原點，可隨染色體復制而復制，重組表達載體能夠穩(wěn)定存在。在甲醇酵母系統(tǒng)中，所有的表達載體均不含酵母復制原點。這就是說，導入酵母體內的重組表達載體只有和酵母染色體上的同源區(qū)發(fā)生重組，整合到染色體上，外源基因才能夠穩(wěn)定存在，外源蛋白才能得到穩(wěn)定表達，這種整合的轉化子一旦形成就非常穩(wěn)定。如果轉化后的重組表達載體未能整合到染色體上，而是以游離的附加體形式存在，這種轉化子就不穩(wěn)定，重組表達載體極易丟失。所以，載體必須整合入酵母基因組中才
4、能實現異源蛋白的穩(wěn)定表達。多數情況下，外源基因多拷貝整合可提高表達水平。一般可采用如下3種方法建立多拷貝表達株：①在表達載體中插入首尾相連的多拷貝表達盒；②在表達載體中插入細菌Tn903Kan基因，因G418抗性水平與載體拷貝數呈正相關；③應用含細菌Shble基因的表達載體，如pPICZ系列，該載體較小，易擴增，具有真光霉素抗性。1、啟動子最常用的啟動子是AOX1啟動子(AOXl，promoter，PA0X)，它的甲醇誘導性很強，因而它控制下的外源基因能得到較高的表達。A0X1基因是從用RNA構建的cDNA文庫中分離的，RNA來自克隆篩選能在甲醇培養(yǎng)基
5、上生長的P．Pasotris細胞。P．Pasotris基因組包含2個基因：AOX1和AOX2，編碼乙醇氧化酶。在序列上這2種AOX蛋白同源性≥97％，并有相似特殊活性，但A0X1表達水平明顯高于AOX2，即啟動能力AOX1大大強于AOX2。細胞中絕大多數乙醇氧化酶的活力是由A0X1提供的。當以甲醇為唯一的生長碳源時，AOX1基因的表達被甲醇嚴格調控，并被誘導到相當高的水平，可占整個細胞可溶蛋白的30％以上。AOX1和AOX2同源性雖然高達97％，但AOX2只承擔很少一部分活力。當A0X1基因缺乏而只存在AOX2時，大部分乙醇氧化酶的活力喪失，細胞利用甲
6、醇能力降低。因此細胞在甲醇介質上生長很慢，這種菌株被稱為Muts；A0X1基因存在時，細胞利用甲醇能力正常，在甲醇介質上生長較快，這種菌株表型被稱為Mut+。A0X1基因的表達為轉錄水平調控。以甲醇為碳源時，生長細胞中約5％mRNA來自于A0X1基因。A0X1基因的調控是兩步過程：抑制機制加上誘導機制。即在以葡萄糖或甘油為碳源的培養(yǎng)基上生長時抑制轉錄；而在以甲醇為唯一生長碳源時，誘導基因轉錄，蛋白表達。最近在P．Pasotris中克隆到一個組成型啟動子：PGAP(三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子)，在它控制下的p.Lacz基因表達率比甲醇誘導下的以PAOX1為
7、啟動子的產量更高。由于該組成型啟動子不需甲醇誘導，發(fā)酵工藝更為簡單，產量高，所以它是一個很有潛力的啟動子。2、選擇標記選擇標記一般為對應于營養(yǎng)缺陷型受體的野生型基因，常用HIs4。由于P．Pasotris不利用蔗糖，所以也可用啤酒酵母的蔗糖酶基因suC2作為標記。AMP：氨芐抗性基因，可在大腸桿菌中篩選。G418和Zeocinr(Invitrogen，sandiego，CA)也是篩選標記，使得到高拷貝的轉化子，這是因為表達載體上外源基因和卡那基因相偶聯。Zeocinr在E.coli和P.Pastoris宿主中都表達，因此縮短了穿梭載體的長度，但Zeoc
8、in是一種強誘變劑，可能導致轉化子產生突變。3、信號肽序列表達蛋白的分泌需要信號肽引導并沿一定
