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《甜高粱蔗糖整合酶基因克隆與轉(zhuǎn)epsps基因研究》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、甜高粱蔗糖整合酶基因克隆與轉(zhuǎn)EPSPS基因研究1前言1.1生物質(zhì)能源作物概況及我國發(fā)展生物質(zhì)能源的合理選擇生物質(zhì)是所有的土地和水生植物以及有機廢物的綜合。生物質(zhì)能源是植物經(jīng)由太陽轄射加工轉(zhuǎn)化的化學態(tài)能量。由于其以植物為能量載體,因此具有穩(wěn)定性和儲能可以同時產(chǎn)生生產(chǎn)能源及物質(zhì)性產(chǎn)品的特點使其具有原料上的多樣性。根據(jù)載體物質(zhì)的不同,現(xiàn)主要將生物質(zhì)能源劃分為四類:油脂類作物、淀粉類作物、糖類作物及木質(zhì)纖維素類作物。涉及發(fā)酵酒精的能源作物主要有淀粉類作物(玉米、木薯、馬鈴薯和小麥等糧食作物)、糖類作物(甘蔗、甜菜和甜高粱等)和纖維素類作物(萬麻等)(徐芬芬等
2、,2006)。生物質(zhì)能源相較于其他能源主要具有資源品種豐富、可再生、抗逆性強、生產(chǎn)周期短、高效能量產(chǎn)出、不受地域限制、環(huán)境友好、生產(chǎn)安全等優(yōu)勢(張衛(wèi)明,2007)。由于生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)市場尚未成熟所造成的企業(yè)投入大,各國政府都出臺了相關(guān)補貼政策以推動本國生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。巴西政府經(jīng)過長達30年的甘蔗發(fā)酵酒精的研究與應(yīng)用,已具備成熟的酒精生產(chǎn)、運輸及分銷體系。瑞典利用作物廢物(甜高粱稻稈等)生產(chǎn)固體成型燃料已經(jīng)發(fā)展的相當成熟;日本改進了從國外引進的固化成型技術(shù),研制了棒狀燃料成型機和相關(guān)的燃料設(shè)備,具備成熟的壓縮型燃料工業(yè)體系;美國國會制定了《生
3、物技術(shù)路線圖》,并新建相關(guān)項目辦公室和技術(shù)咨詢委員會旨在給與進行生物質(zhì)能源開發(fā)的公司政策咨詢及技術(shù)指導(孫宏嶺,2010)。2012年燃料乙醇生產(chǎn)量達到100億加企。1.2能源作物甜高粱的研究進展Linnaeus于1753年首次對高粱進行了定義。之后Moench正式對高粱屬進行了分類。目前所使用的高粱分類學概念為Moench所提出的的。栽培甜高粱隸屬于禾本科高梁族高梁屬甜高梁種下的亞種,拉rr名為Sorghumbicolor(Lin)Moenchsubsp.bicolor,英文名為sorghum,英文中的sorghum還指甜高粱種甚至泛指高粱屬植物(
4、BarkaJ.H等2007)。甜高粱作為能源植物具有以下幾點優(yōu)勢:首先,甜高粱具有很強的生長能力。在廣西一年可種植兩季,北方可種植一季,單株最高可達5米,每公頃可產(chǎn)糧食5000kg,每公頃糖產(chǎn)量約為75噸,高產(chǎn)紀錄為160t/hin2;其次,甜高粱具有抗逆性強、適應(yīng)性廣的特點。其在三十多度高溫干旱惡劣環(huán)境下,柱頭和花粉仍可維持2小時左右生活力,而此種環(huán)境下的玉米只有十幾分鐘的壽命。其對鹽堿的承受濃度也高于玉米燈作物,能耐受的鹽濃度范圍為0.5%-0.9%,譬如:將甜高粱種植在山東濱州鹽堿地上,最高畝產(chǎn)甜高粱鮮結(jié)稈仍可達5565kg。其適應(yīng)性廣,在pH
5、5-8.5的各種類型土壤中均可栽培,在l0以上積溫達2600tM50就可以生長,因此只要選在合適品種,我國各省均可種植甜高粱。甜高粱主要通過種子繁殖,適于機械播種和收獲(PengY等,1999);再次,田宜水等(2011)年對甜高粱蓮干乙醇全生命周期的分析表明:甜高粱乙醇能量產(chǎn)出投入比為1.34,相較于玉米乙醇生命周期的能量產(chǎn)比小于1,木薯乙醇技術(shù)路線在生命周期化石能消耗與傳統(tǒng)汽油技術(shù)路線相比并無優(yōu)勢,甜高粱乙醇作為生物質(zhì)能源具有很大優(yōu)勢;最后,隨著科技的發(fā)展,新型技術(shù)不斷應(yīng)用于甜高粱蓮干發(fā)酵乙醇中去。王聞等于2011年中國可再生能源學會上就發(fā)表了一
6、種促進甜高粱桿漁酶解的試驗方法,大大提高了了其聚糖轉(zhuǎn)化率。2北甜三號簾糖合成酶基因克隆2.1材料與方法購于北京天恩澤公司的DNA片段回收試劑盒,購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的T4DNAligase、X-gal、IPTG,以及購于TAKARA公司的LA-Taq高保真酶。常用溶液、緩沖液均用蒸饋水配制,15Mpa壓力下濕熱滅菌20分鐘。常用試劑如下:2XCTAB:100l/LTris-Hcl,20mmol/LEDTA,1.4mol/LNacl,2%CTAB,2%PVP,0.4%巰基乙醇;氯仿/異戊醇(24:1):配置100體積比的氯仿/異戊醇需氯
7、仿96ml,異戊醇4ml;CTAB/Nacl:15%CTAB,OJmol/LNacl;TE溶液:l0mol/LTris-Cl,1mmol/LEDTA,PH8.0;異丙醇;75%乙醇;5XTBE:54gTris,27.5g硼酸,20ml0.5mol/LEDTA(PH8.0),使用時稀釋10倍;50XTAE:24.2gTris,10ml0.5mol/LEDTA(PH8.0),5.71ml冰醋酸,使用時稀釋50倍;X-gal(5-溴-4氯-3n引哚-P-D-半乳糖苷)It備液:用二甲基甲酰胺配制20mg/ml濃度的X-gal母液,裝入2rnl離心管中,裝溶
8、液的離心管應(yīng)以黑色遮光紙包裹,這是由于X-gal易于見光分解。之后將其置于-20°C條件下保存。注: