epsps基因與bar基因的克隆及在蓖麻中的功能驗(yàn)證

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1、分類號０３５．３學(xué)校代碼１０１３６ＩＣＳ２化２００００１學(xué)號￣￣￣＾＂＾＊ＣｉＩ均古氏燕大等覇ｉｉｉ象；碩±學(xué)位論文ｒ份巧凹基因與說《＊基因的克隆及在茜麻中的功能驗(yàn)證ＥＷＷＧｅｎｅａｎｄ此ｊｒＧｅｎｅＣｌｏｎｈｉｇａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＶｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣａｓｔｏｒ申請人；羅蕊＾；學(xué)科專業(yè)：作物栽培學(xué)與耕作學(xué)３藝ｍＳ異？二—￣＾＿￣研究方向；作物生物技術(shù)茜ｉ山ＳＳ—：？——．？－１二三

2、１＾：子Ｊ＾二＾二＾學(xué)位類別：學(xué)術(shù)學(xué)位＾胃漂胃臺畫誦指導(dǎo)教師：陳永勝教授胃節(jié)ｉｉｉｇ黃鳳蘭教授．論文提交日期二〇—五年四月：？內(nèi)蒙古民族大學(xué)碩±學(xué)位論文作者聲明本人聲明；本人呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下取得的研究成果。對前人及其他人員對本論文的啟發(fā)和貢獻(xiàn)已在論文中做出了明確的聲明，并表示了感謝。論文中＋除了特別加標(biāo)注和致謝的地方夕ｂ不包含其他人己經(jīng)發(fā)表或撰寫的研究成果。本人同意內(nèi)蒙古民族大學(xué)保留并向國家有關(guān)部口或資料庫送交。本人授權(quán)內(nèi)蒙古民族大＾學(xué)位論文或電子版，允許論文被查閱和借閱’學(xué)可臥將本人

3、學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，。可采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編學(xué)位論文、作者答名；日期：：．．．＊－．．．．．—．．—．－．－＇＾．－一．．ＶＴ，‘Ｖ心Ｉ公－．…二分類號035.3學(xué)校代碼10136ICS學(xué)號201200001cDNA-AFLP技術(shù)分離蓖麻矮化相關(guān)基因SeparartionofDwarf碩士學(xué)位論文-relatedGenesofCastorbyUsingcDNA-AFLPTechnologyEPSPS基因與Bar基因的克隆及在蓖麻中的功能驗(yàn)證EPSPSGeneandB

4、arGeneCloningandFunctionalVerificationoftheCastor申請人：羅蕊學(xué)科專業(yè)：作物栽培學(xué)與耕作學(xué)研究方向：作物生物技術(shù)學(xué)位類別：學(xué)術(shù)學(xué)位指導(dǎo)教師：陳永勝教授黃鳳蘭教授論文提交日期：二○一五年四月摘要蓖麻（RicinuscommunisL.）是世界十大油料作物之一。目前，尚未有轉(zhuǎn)基因抗除草劑蓖麻品種。本試驗(yàn)以蓖麻優(yōu)良父本“2129”為試驗(yàn)材料，通過PCR擴(kuò)增法，克隆EPSPS基因和Bar基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-Bar-EPSPS，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將EPSPS基因和Bar基因同時(shí)轉(zhuǎn)到蓖麻體內(nèi)。為培育具有抗

5、除草劑的蓖麻新品種奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)的研究結(jié)果如下：1根據(jù)GenBank中公布的EPSPS基因序列以及重疊延伸PCR的原理，設(shè)計(jì)了19對引物，引物長度為60pb，并且相鄰兩個(gè)引物之間有20pb的堿基重疊，在第19對引物的兩端加入酶切位點(diǎn)XhoI。根據(jù)Bar基因序列及重疊延伸PCR的原理，設(shè)計(jì)11對引物，引物長度為60bp，并且相鄰引物之間有20bp堿基重疊，在第11對引物的兩端分別添加酶切位點(diǎn)NcoI、BstEⅡ。采用PCR擴(kuò)增法，獲得EPSPS基因和Bar基因的全長序列，分別經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定、測序、分析比對后，得到EPSPS、Bar基因1529bp、831

6、bp全長序列。2將表達(dá)載體質(zhì)粒pCAMBIA3301線性化，用NcoI、BstEⅡ?qū)ar基因從克隆載體上切下，然后將二者連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、鑒定，獲得pCAMBIA3301-Bar質(zhì)粒。用XhoI將pCAMBIA3301-Bar線性化，將EPSPS基因從克隆載體上切下，將二者連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、鑒定，獲得pCAMBIA3301-Bar-EPSPS表達(dá)載體，并確定EPSPS基因連接方向正確。3將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-Bar-EPSPS通過凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105中。4對蓖麻子葉節(jié)的抗草銨膦濃度進(jìn)行篩選，最終確定在抗性篩選培養(yǎng)基中，加入0.1m

7、g/L的草銨膦時(shí)為最適濃度。5采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將pCAMBIA3301-Bar-EPSPS對蓖麻子葉節(jié)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)抗性篩選最終獲得抗性植株72株。經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測，1株為轉(zhuǎn)基因植株。關(guān)鍵詞：蓖麻；抗除草劑；EPSPS基因；Bar基因EPSPSGeneandBarGeneCloningandFunctionalVerificationoftheCastorAbstractCastor(RicinuscommunisL.)isoneoftheworld'stoptenoilcrops.Currently,thereisnothaveatransgenicherb

8、icide