重組人乙酰肝素酶多肽片段的表達與純化

《重組人乙酰肝素酶多肽片段的表達與純化》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在學術論文-天天文庫。

1、萬方數(shù)據(jù)軍事醫(yī)學科學院院刊2009年6月第33卷第3期BullAcadMilMedSci。Jun2009；Vol33No3重組人乙酰肝素酶多肽片段的表達與純化高紅偉，田曙光，李素波，崔真源，劉至玄，官鋒’(軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所，北京100850)乙酰肝素酶(heparanase，HPA)是一種內(nèi)源性B一葡萄糖醛酸酯酶，為迄今發(fā)現(xiàn)的唯一作用于細胞外基質多聚糖硫酸乙酰肝素蛋白多糖的內(nèi)切酶?。它能夠特異性地識別硫酸乙酰肝素(heparansulfate，HS)結構，并能將其降解為含lO～20個糖單位的寡

2、糖鏈B’3J。近20余年，有關乙酰肝素酶的研究表明，乙酰肝素酶對機體的發(fā)育、炎癥過程、血管生成、腫瘤轉移均有重要的作用∞t7J。目前，人們普遍關注的是惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展均伴有乙酰肝素酶的高表達，這意味著：①基底膜的完整性遭到破壞，腫瘤細胞將突破局限轉移至他處或穿透基底膜進入血管；②乙酰肝素酶促血管生成作用為侵襲、轉移的腫瘤細胞提供了定居、生長所需營養(yǎng)。因此，乙酰肝素酶對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用。目前，由于乙酰肝素酶抗體研發(fā)剛剛起步，抗體數(shù)量少、造價高，制約了對血清乙酰肝素酶檢測的研究，僅國外有少量報

3、道∽j1，因此，盡早研制開發(fā)抗乙酰肝素酶抗體凸顯重要。本文通過BioSun軟件計算人乙酰肝素酶的優(yōu)勢抗原表位，選擇克隆編碼乙酰肝素酶蛋白第72～171個氨基酸的300個堿基，成功構建了含乙酰肝素酶的優(yōu)勢抗原區(qū)的融合蛋白表達載體，并在大腸桿菌中實現(xiàn)了GST．HPAl00融合蛋白的可溶性表達，為制備特異性的單抗及乙酰肝素酶抗體的鑒定奠定了基礎。1材料和方法1．1材料和試劑乙酰肝素酶全長cDNA表達質粒pcDNA3．1-HPA為本實驗室保存怕J。大腸桿菌DHSct和BL21(DE3，PIyS)感受態(tài)購自博邁德公

4、司，pGEX．4T2購自GE公司，pGEM．T載體、T4DNA連接酶為Promega公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶EcoRI,X／wI為TaKaRa公司產(chǎn)品，質粒提取試劑盒和DNA純化試劑盒為Promega公司產(chǎn)品，ECL顯色試劑為威格拉斯公司產(chǎn)品，Glu·tathioneSepharose4B和PVDF膜為GE公司產(chǎn)品，GST單抗為天根公司產(chǎn)品。EasySeeWesternMarker為全式金公司產(chǎn)品。乙酰肝素酶單抗為Abnova公司產(chǎn)品。1．2優(yōu)勢抗原表位分析人乙酰肝素酶cDNA全長1632bp，編碼543個

5、氨基酸川，采用BioSun軟件分析乙酰肝素酶蛋白的空間結構，計算得出多個優(yōu)勢抗原表位(圖1)，其中箭頭所指處為2個較理想的抗原表位，為使免疫效果更明顯，我們選擇了包括這2個優(yōu)勢表位的一段肽段(72—171，共100個氨基酸)為免疫原。1．3人乙酰肝素酶抗原區(qū)片段的克隆、表達質粒pGEX-4T-2·HPA300的構建及鑒定以人乙酰肝素酶全長表達質粒peDNA3．1-HPA為模板，、?！?，、八八八f＼。／．爪廠＼V擴。＼／VV州＼Eprtopecurvefortheseouence：SEONl【1．5431

6、圖1人乙酰肝素酶抗原表位分析圈峰值最高的2個峰為兩個較理想的抗原表位，分別位于第108—120及157～169位氨基酸進行PCR。上游引物：5'-GCG從rI’11CTCATCCTcCTGGGT-3’：下游引物：5'-CGAGATCTACAGAGC7丌CrI’I'cAG-3’。兩側分別引入酶切位點EcoRI和XhoI。PcR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切后直接克隆人載體pGEx一4T-2，構建表達質粒pGEx_4T-2-HPA300，轉化入DH50t，酶切鑒定后進行序列測定。1．4目的蛋白的誘導表達及可

7、溶性分析將重組表達質粒pGEx4T-2-HPA300轉化大腸桿菌BL21(DE3，PLySplysS)，培養(yǎng)至D啪為0．6時，采用不同誘導溫度和不同的IPTG濃度誘導目的蛋白的表達。離心收集菌體，超聲波低溫破碎菌體，離心，分別取上清和沉淀進行SDS·PAGE分析，確定最佳誘導溫度和IPTG濃度。1．5目的蛋白的純化離心收集菌體沉淀，按比例(重懸液：菌液=1：10)用PBS重懸。加入溶菌酶使其終濃度為0．1mg／na，370C水浴中反應0．5h后在冰水浴中超聲10min，10000r／min離心15min，

8、所得上清用GlutathioneSepharose4B進行親和層析，平衡液A為PBS緩沖液(pH7．4)，洗脫液B為50mmol／LTris·HCl，pH8．0，10mmoVL還原型谷胱甘肽。分別收集上樣流出液、洗脫液，電泳分析純化效果。1．6Western印跡鑒定．表達的目的蛋白經(jīng)12％SDS-PAGE分離后，轉印至PVDF膜上，用含5％脫脂奶粉的1’BST(20mmol／L'IrispH7．5。100mmol／LNaCl，