重組人乙酰膽堿酯酶的表達(dá)純化及其抑制劑篩選

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1、＇類號－＾？？密絞公化ＵＤＣ６３０全曰制碩±專藍(lán)學(xué)位研究生學(xué)位論文重組人公賺膽堿釀酶的表達(dá)純化及其抑制劑篩選作者姓名；乂怖巧指導(dǎo)教師；書向華副教授專業(yè)學(xué)位名稱；農(nóng)業(yè)備ｒ傾Ｉ：領(lǐng)域名稱；ｉＬ＿ｉ研究方向：林業(yè)與化物巧術(shù)ｉ所在學(xué)院：林化ｊ化物巧術(shù)學(xué)院論文提交日期：２０１５年１２Ｗ１８日浙狂農(nóng)林大學(xué)２０１５年１２月獨(dú)創(chuàng)性聲明，２０２ＦＲ０８０本人聲明，所呈交的學(xué)位論文是受浙江農(nóng)林大學(xué)科研發(fā)展基金（基金編號：１），在指導(dǎo)教師指導(dǎo)下，通過自己的努力取得的成果，并且是自己撰寫的，資助。盡我所知除了

2、文中作了標(biāo)注和致謝中己經(jīng)作了管謝的地方外，論文中不包含其他人發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不拉含在浙江農(nóng)巧大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)獲得學(xué)位或證書而使用過的材料一。與我同對本研究做出．都在論文中作了明確的說明并表示了謝意，貢獻(xiàn)的同志。如被查有嚴(yán)重侵犯他人知巧產(chǎn)權(quán)的行為由本人承擔(dān)應(yīng)有的責(zé)任。＾；日期１７學(xué)位論文作者親筆簽名；Ｗ文？論文使用授權(quán)的說明本人完全Ｔ解浙江農(nóng)林大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán)送交論文的復(fù)印件，允許論文被查閱和借網(wǎng)Ｉ；學(xué)?？蓮墓颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容可采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。，在年后解巧可

3、適。□本授保密＿用權(quán)書不密論文屬。保本學(xué)位于不保密，＂＂Ｖ（）請?jiān)诜娇騼?nèi)打、＞ｉｉ１位論：批文作者簽名：日學(xué)親筆期＾０ｊ。，簽：Ｂ期：心）指導(dǎo)名／教師親筆方ZhejiangAgriculture&ForestryUniversityMasterDegreeThesisExpressionandpurificationofrecombinanthumanacetylcholinesteraseandscreeningofitsinhibitorsCandidate:WuHuaixiuSupervisor:WangXiangjunAssoci

4、ateSupervisor:QianYongchangSpecialty:ForestryDateofSubmission:October06,2015ZhejiangA&FUniversityLin’an,Zhejiangprovince,P.R.ChinaDecember,2015摘要摘要乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)作為一種存在于膽堿能突觸間隙的由蛋白質(zhì)分子構(gòu)成的生物催化劑，屬于生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性的酶。它不僅參與細(xì)胞的生長以及發(fā)育，同時(shí)對神經(jīng)的再生和神經(jīng)元的發(fā)育也有促進(jìn)作用，并對維持人體神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理功能占有著非

5、常重要的地位。乙酰膽堿（Acetylcholine,ACh）是AChE的水解底物，ACh會受AChE的催化發(fā)生裂解反應(yīng)，導(dǎo)致ACh的缺失，從而使得各神經(jīng)信號傳遞失敗。而ACh水平的降低或活性的異常則是造成阿爾茨海默?。ˋlzheimer’sdisease,AD）發(fā)生的主要原因。近年來，通過提高ACh的水平來治療AD，這已經(jīng)成為目前主要的治療方式。因此，通過抑制AChE來恢復(fù)或提高ACh的水平是治療AD持續(xù)有效的方法。乙酰膽堿酯酶抑制劑(Acetylcholinesteraseinhibitor,AChEI)能夠選擇性的抑制腦內(nèi)AChE的活性，使ACh在大腦內(nèi)的存留時(shí)

6、間延長，提高AD病人的膽堿神經(jīng)功能，同時(shí)也能有效緩解病人的認(rèn)知能力障礙降低病人。迄今為止，對于輕、中度的AD治療AChEI已經(jīng)成為主流產(chǎn)品。經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)上市的6種AChEI，它們分別是他克林(Tararine)、加蘭他敏(Galanthamine)、利伐司替明（Rivastigmine)、石杉堿甲(HuperzineA)以及復(fù)方新藥Namzari和多奈哌齊(Donepezil，E2020),但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的AChEI還有較多缺點(diǎn)存在，例如半衰期短、毒性大以及較嚴(yán)重的膽堿能外周系統(tǒng)的副作用等，這使得它們在臨床應(yīng)用上面受到一定限制。因此,尋找發(fā)現(xiàn)作用時(shí)間長、副作用小的

7、新一代AChEI仍是目前治療AD藥物的研究熱點(diǎn)。本研究旨在利用體外人胚腎（HEK293）細(xì)胞建立表達(dá)重組人乙酰膽堿酯酶（Recombinanthumanacetylcholinesterase,rhAChE）的表達(dá)系統(tǒng)，使用pCMV-AChE質(zhì)粒對其進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，分泌表達(dá)酶液到培養(yǎng)基，并通過對酶動力學(xué)的研究來考察重組表達(dá)蛋白的酶活性。使用DEAE-SepharoseFF親和層析對高效表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化，以獲得純度較高、活性較強(qiáng)的重組人乙酰膽堿酯酶，從而建立重組人乙酰膽堿酯酶抑制劑的體外評價(jià)篩選模型，并應(yīng)用該模型從天然產(chǎn)物及其衍生物中篩選其中藥抑制劑和對一系列