重組人乙酰肝素酶多肽片段的表達(dá)與純化

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1、萬(wàn)方數(shù)據(jù)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊2009年6月第33卷第3期BullAcadMilMedSci。Jun2009；Vol33No3重組人乙酰肝素酶多肽片段的表達(dá)與純化高紅偉，田曙光，李素波，崔真源，劉至玄，官鋒’(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所，北京100850)乙酰肝素酶(heparanase，HPA)是一種內(nèi)源性B一葡萄糖醛酸酯酶，為迄今發(fā)現(xiàn)的唯一作用于細(xì)胞外基質(zhì)多聚糖硫酸乙酰肝素蛋白多糖的內(nèi)切酶?。它能夠特異性地識(shí)別硫酸乙酰肝素(heparansulfate，HS)結(jié)構(gòu)，并能將其降解為含lO～20個(gè)糖單位的寡

2、糖鏈B’3J。近20余年，有關(guān)乙酰肝素酶的研究表明，乙酰肝素酶對(duì)機(jī)體的發(fā)育、炎癥過(guò)程、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移均有重要的作用∞t7J。目前，人們普遍關(guān)注的是惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展均伴有乙酰肝素酶的高表達(dá)，這意味著：①基底膜的完整性遭到破壞，腫瘤細(xì)胞將突破局限轉(zhuǎn)移至他處或穿透基底膜進(jìn)入血管；②乙酰肝素酶促血管生成作用為侵襲、轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞提供了定居、生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)。因此，乙酰肝素酶對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用。目前，由于乙酰肝素酶抗體研發(fā)剛剛起步，抗體數(shù)量少、造價(jià)高，制約了對(duì)血清乙酰肝素酶檢測(cè)的研究，僅國(guó)外有少量報(bào)

3、道∽j1，因此，盡早研制開(kāi)發(fā)抗乙酰肝素酶抗體凸顯重要。本文通過(guò)BioSun軟件計(jì)算人乙酰肝素酶的優(yōu)勢(shì)抗原表位，選擇克隆編碼乙酰肝素酶蛋白第72～171個(gè)氨基酸的300個(gè)堿基，成功構(gòu)建了含乙酰肝素酶的優(yōu)勢(shì)抗原區(qū)的融合蛋白表達(dá)載體，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了GST．HPAl00融合蛋白的可溶性表達(dá)，為制備特異性的單抗及乙酰肝素酶抗體的鑒定奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1．1材料和試劑乙酰肝素酶全長(zhǎng)cDNA表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3．1-HPA為本實(shí)驗(yàn)室保存怕J。大腸桿菌DHSct和BL21(DE3，PIyS)感受態(tài)購(gòu)自博邁德公

4、司，pGEX．4T2購(gòu)自GE公司，pGEM．T載體、T4DNA連接酶為Promega公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶EcoRI,X／wI為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒和DNA純化試劑盒為Promega公司產(chǎn)品，ECL顯色試劑為威格拉斯公司產(chǎn)品，Glu·tathioneSepharose4B和PVDF膜為GE公司產(chǎn)品，GST單抗為天根公司產(chǎn)品。EasySeeWesternMarker為全式金公司產(chǎn)品。乙酰肝素酶單抗為Abnova公司產(chǎn)品。1．2優(yōu)勢(shì)抗原表位分析人乙酰肝素酶cDNA全長(zhǎng)1632bp，編碼543個(gè)

5、氨基酸川，采用BioSun軟件分析乙酰肝素酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)，計(jì)算得出多個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位(圖1)，其中箭頭所指處為2個(gè)較理想的抗原表位，為使免疫效果更明顯，我們選擇了包括這2個(gè)優(yōu)勢(shì)表位的一段肽段(72—171，共100個(gè)氨基酸)為免疫原。1．3人乙酰肝素酶抗原區(qū)片段的克隆、表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2·HPA300的構(gòu)建及鑒定以人乙酰肝素酶全長(zhǎng)表達(dá)質(zhì)粒peDNA3．1-HPA為模板，、?！?，、八八八f＼。／．爪廠＼V擴(kuò)。＼／VV州＼Eprtopecurvefortheseouence：SEONl【1．5431

6、圖1人乙酰肝素酶抗原表位分析圈峰值最高的2個(gè)峰為兩個(gè)較理想的抗原表位，分別位于第108—120及157～169位氨基酸進(jìn)行PCR。上游引物：5'-GCG從rI’11CTCATCCTcCTGGGT-3’：下游引物：5'-CGAGATCTACAGAGC7丌CrI’I'cAG-3’。兩側(cè)分別引入酶切位點(diǎn)EcoRI和XhoI。PcR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切后直接克隆人載體pGEx一4T-2，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pGEx_4T-2-HPA300，轉(zhuǎn)化入DH50t，酶切鑒定后進(jìn)行序列測(cè)定。1．4目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可

7、溶性分析將重組表達(dá)質(zhì)粒pGEx4T-2-HPA300轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3，PLySplysS)，培養(yǎng)至D啪為0．6時(shí)，采用不同誘導(dǎo)溫度和不同的IPTG濃度誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。離心收集菌體，超聲波低溫破碎菌體，離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS·PAGE分析，確定最佳誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度。1．5目的蛋白的純化離心收集菌體沉淀，按比例(重懸液：菌液=1：10)用PBS重懸。加入溶菌酶使其終濃度為0．1mg／na，370C水浴中反應(yīng)0．5h后在冰水浴中超聲10min，10000r／min離心15min，

8、所得上清用GlutathioneSepharose4B進(jìn)行親和層析，平衡液A為PBS緩沖液(pH7．4)，洗脫液B為50mmol／LTris·HCl，pH8．0，10mmoVL還原型谷胱甘肽。分別收集上樣流出液、洗脫液，電泳分析純化效果。1．6Western印跡鑒定．表達(dá)的目的蛋白經(jīng)12％SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用含5％脫脂奶粉的1’BST(20mmol／L'IrispH7．5。100mmol／LNaCl，