大蒜中sod活性測(cè)定

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1、大蒜中SOD活性的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模海?）掌握SOD酶的提取、分離、檢測(cè)一般步驟。（2）了解酶在提取過程中的兩個(gè)參數(shù)：回收率、純化倍數(shù)。（3）掌握離心機(jī)的使用。二、實(shí)驗(yàn)原理:鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O2-，生成帶色的中間產(chǎn)物，中間物的積累在滯留30～45s后，與時(shí)間成線性關(guān)系，一般線性時(shí)間維持在4min的范圍內(nèi)，中間物在420nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)烈光吸收。當(dāng)有SOD存在時(shí)，由于它能催化O2-與H+結(jié)合生成O2和H2O2，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累，因此，通過測(cè)定光吸收即可求出SOD的酶活性。三、實(shí)驗(yàn)試劑：大蒜、冷丙酮、磷酸緩沖液（PH7.8，0.

2、05mol/L)、氯仿-乙醇混合液、鄰苯三酚、濃鹽酸、天平、石英砂、研缽、冷凍離心機(jī)、50mL離心管8個(gè)、紫外-可見分光光度計(jì)、250mL三角瓶8個(gè)、玻璃棒8根、試劑瓶250mL3個(gè)、500mL3個(gè)、250mL燒杯16個(gè)、試管帶膠塞80根、移液管各5根四、實(shí)驗(yàn)步驟：（1）SOD提取：稱取5g大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎細(xì)胞，加入15mL的PH7.80.05mol/L的磷酸緩沖液，研磨攪拌20分鐘，使SOD充分溶解，6000rpm離心，棄去沉淀，得上清液。(留出1mL備用，準(zhǔn)確量取剩余上清液體積，記錄)（2）除雜蛋白：提取液加入1/4體積的氯仿-乙醇混合液攪

3、拌10min，6000rpm離心15min去沉淀，得粗酶液。（取1mL粗酶液備用,精確測(cè)量剩余粗酶液體積）（3）SOD酶的沉淀分離：剩余的粗酶液中加入等體積的冷丙酮，攪拌15min，6000rpm離心15min，得到SOD酶沉淀。將沉淀先加2mL磷酸緩沖液，溶解后再加3mL混勻。6000rpm離心15min，取上清得到SOD酶液。取1mL備用，其余量取體積。（4）粗酶液活性測(cè)定：提取液、粗酶液、酶液中SOD活力檢測(cè)，具體步驟如下。加入鄰苯三酚后迅速混勻，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)4min，加一滴濃鹽酸停止反應(yīng)，420nm測(cè)吸光值。試劑/（mL）空白管對(duì)照管OD1提取液OD2

4、粗酶液OD2酶液OD2PH8.3緩沖液33333SOD提取液000.10.10.1蒸餾水21.81.71.71.7室溫放置20min鄰苯三酚00.20.20.20.2（5）溶液中可溶性蛋白含量測(cè)定：分別從1mL備用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3mL按以下倍數(shù)稀釋，260nm/280nm測(cè)定吸光值，按公式計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。提取液稀釋：50×粗酶液稀釋：20×酶液稀釋：10×五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：提取液粗酶液酶液總體積（ml）提取液粗酶液酶液260nm吸光度值280nm吸光度值公式蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=(1.45A280－0.74A260)×稀釋倍數(shù)蛋白質(zhì)濃度（m

5、g/ml）對(duì)照管（OD1）提取液（OD2）粗酶液（OD2）酶液（OD2）420nm吸光值六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)處理：（1）酶活力單位提取液酶活力單位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=粗酶液活力單位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=酶液活力單位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=（2）總活力提取液總活力U=活力單位×總體積=粗酶液總活力=活力單位×總體積=酶液總活力=活力單位×總體積=（3）比活力提取液酶液比活力U/mg=活力單位/蛋白質(zhì)濃度=粗酶液比活力U/mg=活力單位/蛋白質(zhì)濃度=酶液比活力U/mg=活力單位/蛋白質(zhì)濃度=（4）純化倍數(shù)粗酶液純化

6、倍數(shù)=粗酶液比活力/提取液比活力=酶液純化倍數(shù)=酶液比活力/提取液比活力=（5）回收率粗酶液回收率=粗酶液總活力/提取液總活力=酶液回收率=酶液總活力/提取液總活力=七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差分析：（1）研磨和離心大概還不夠充分。（2）由于測(cè)量?jī)x器的精密度引起的誤差。（3）在操作的過程中，加入鄰苯三酚后未混合均勻，可能致使化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行得不很充分，這可能是造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與預(yù)期不符的一個(gè)原因；（4）在實(shí)驗(yàn)過程中，所需化學(xué)試劑加入的量不是很準(zhǔn)確，這可能是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)出現(xiàn)問題的另一個(gè)原因；（5）此外，實(shí)驗(yàn)本身還很粗糙，酶的提取、分離和純化都不能十分徹底，還有很多雜蛋白干擾實(shí)驗(yàn)。氮

7、藍(lán)四唑（NBT）法測(cè)定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于動(dòng)、植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子自由基的酶。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)超氧物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生O2，可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除O2，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計(jì)算出酶活性大小。