抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性測定方法

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1、抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性測定方法酶液制備：取0.2g（可視情況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預(yù)冷的研缽中，加入1.6ml50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4℃、12000g下離心20min，上清液即為酶液。一、超氧化物歧化酶（SOD）活性測定（氮藍(lán)四唑光化還原法）1、試劑的配制（1）0.05mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液:取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子

2、量156.01）31.2g。分別用蒸餾水定容到1000ml。0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：分別取A母液(Na2HPO4)228.75ml，B母液(NaH2PO4)21.25ml，用蒸餾水定容至1000ml。參考文獻(xiàn)：李合生主編：植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù).高等教育出版社，2000：267～268。（2）130mM甲硫氨酸溶液：取1.9399gMet用磷酸緩沖液（pH7.8）定容至100ml。（3）100μMEDTA-Na2溶液：取0.03721gEDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至1000ml。（4）20μM核黃素溶液：取0.0753g核黃素用蒸餾水液定容至

3、1000ml，避光保存。（5）750uM氮藍(lán)四唑(NBT)溶液：取0.06133gNBT用PBS定容至100ml，避光保存。2、酶活性測定（1）取10ml試管（要求透明度好）測試管：分別依次加入3.5ml緩沖液+0.5ml甲硫氨酸（Met）溶液+0.5ml氮藍(lán)四唑（NBT）溶液+0.5mlEDTA-Na2溶液+0.4ml蒸餾水(混合后搖勻)+0.1ml酶液+0.5ml核黃素溶液；對照管（2個）：分別依次加入3.5ml緩沖液+0.5ml甲硫氨酸（Met）溶液+0.5ml氮藍(lán)四唑（NBT）溶液+0.5mlEDTA-Na2溶液+0.5ml蒸餾水(混合后搖勻)+0.5ml核黃素溶

4、液；其中1支試管照光后測定作為最大光還原管，另1支置于暗中測定時用于調(diào)零。（2）將一支對照管置于暗處，其余試管置于光照培養(yǎng)箱中在4000lux光照下反應(yīng)20min；（4）以不照光的對照管調(diào)零后，避光測OD560(出現(xiàn)顏色即可測定)。（5）酶活性計(jì)算：SOD活性單位以抑制NBT光化還原50％所需酶量（測的樣品值要在最大管的一半左右才合適，否則要調(diào)整酶量）為1個酶活單位（u）。SOD總活性＝[(Ack-AE)×V]/（1/2Ack×W×Vt）SOD比活力＝SOD總活性/蛋白質(zhì)含量SOD總活性以鮮重酶單位每克表示（u/gFW）；比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；Ack為照光對照

5、管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（ml,1.6ml，加入PBS的體積)；Vt為測定時的酶液用量（ml，30ul）；W為樣品鮮重（g，測定時應(yīng)換算為葉綠體的質(zhì)量mg）；蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。二、POD、CAT酶活性的測定粗酶液制備同SOD。1、過氧化物酶（POD）活性測定（愈創(chuàng)木酚法）（1）試劑配制：100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)：分別取A母液(Na2HPO4)6.15ml和B母液(NaH2PO4)43.85ml混勻即為100mlPBS；（2）反應(yīng)混合液配制（以24個樣為準(zhǔn)）：取75mlPBS(100mM，pH6.0)，加入42ul液體（原

6、液）愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚）加熱攪拌溶解，冷卻后加入28.5ul30％的H2O2，混勻后保存于冰箱中備用。（3）樣品測定：空白對照：3ml反應(yīng)混合液+1ml蒸餾水，作為對照調(diào)零；測試管：3ml反應(yīng)混合液+1ml酶液，立即開啟秒表；測定OD470值（測定40秒），每隔30s讀一次數(shù)。讀四分鐘,共8次。（4）酶活性計(jì)算：以每minOD值變化（升高）0.01為1個酶活性單位（u）。POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）(u/gmin)ΔA470：為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時間(min)；Vt為提取酶液總體積（ml，(1.6ml）；V

7、s為測定時取用酶液體積（ml，30ul）。2、過氧化氫酶（CAT）活性測定（1）試劑配制：0.15mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4)457.5ml和B母液(NaH2PO4)292.5ml混合后用蒸餾水定容至1000ml。（2）反應(yīng)液配制：取200mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml30%的H2O2（原液）搖勻即可。（3）樣品測定：取3ml反應(yīng)液加入0.1ml（可視情況調(diào)整）酶液，以PBS為對照調(diào)零，測定OD240（紫外）（每隔5s讀一次數(shù)，測定1min）。（4）酶活性計(jì)算：以每