SOD_CAT及POD活性的測定

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1、測定方法一．SOD，CAT及POD活性的測定分別取0.4ｇ材料于預(yù)冷的研缽中，加入8ml預(yù)冷的50mmol-1磷酸緩沖液（pH7.8）（先加2ml,在冰浴下研磨成勻漿后，將勻漿轉(zhuǎn)入10ml離心管，再用6ml沖洗），10000rpm離心15min，取上清液定容至10ml后于4℃保存。上清液用于可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD活性及POD活性的測定。SOD活性測定1.顯色反應(yīng)取5mL指形管（要求透明度好）4支，2支為測定管，另2支為對照管，按表47–1加入各溶液?；靹蚝?，給1支對照管照上比試管稍長的雙層黑色硬紙?zhí)渍诠?，與其他各管同時置于4000lx日光燈下反應(yīng)20-30min

2、(要求各管照光情況一致，反應(yīng)溫度控制在25～35℃之間，使酶活性高低適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)時間)。當(dāng)樣品數(shù)量較大時，可在臨用前根據(jù)用量將表47–1中各試劑(酶液和核黃素除外)按比例混合后一次加入2.65mL，然后依次加入核黃素和酶液，使終濃度不變。??表47-1各溶液顯色反應(yīng)用量試劑酶）用量(mL)終濃度(比色時)0.05mol/L磷酸緩沖液1.5?130mmol/LMet溶液0.313mmol/L750μmol/LNBT溶液0.375μmol/L100μmol/LEDTA-Na2液0.310μmol/L20μmol/L核黃素0.32.0μmol/L酶液0.12支對照管以緩

3、沖液代替酶液蒸餾水0.5?總體積3.3?3.SOD活性測定至反應(yīng)結(jié)束后，用黑布罩蓋上試管，終止反應(yīng)。以遮光的對照管作為空白，分別在560nm下測定各管的OD值，計算SOD活性。3.<結(jié)果計算>已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位表示，按下式計算SOD活性。SOD總活性[u/g(FW)]=式中：SOD總活性以酶單位每克鮮重表示。比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示。ACK——照光對照管的吸光度。AE——樣品管的吸光度。VT——樣品液總體積，mL。V1——測定時樣品用量，mL。W——樣品鮮重，g。蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶

4、（POD）活性1.取兩支試管，洗滌后甩干水分。試劑管號（對照）測定管0.05mol/LPH5.5的磷酸緩沖液2.9ml2.9ml2%雙氧水溶液0ml1.0ml0.05mol/L愈創(chuàng)木酚溶液1.0ml1.0ml蒸餾水3.0ml2.0ml總體積7.0ml7.0ml　　將上述各管立即放入預(yù)先調(diào)好37℃的水浴鍋中保溫5min以上（酶促反應(yīng)），向?qū)φ展苤屑尤?.1ml酶液，混勻，在λ470nm處調(diào)零，再向測定管中加入0.1ml酶液，并且立即計時，混勻后進(jìn)行比色測定，3分鐘時立即讀取吸光度。（也可以每分鐘讀取一次，3分鐘內(nèi)吸光度變化值ΔA）2.結(jié)果計算以每分鐘吸光度變化值表示

5、酶活性大小，即以ΔA470/[min·g（鮮重）]表示之。也可以用每min內(nèi)A470變化0.01為1個過氧化物酶活性單位（u）表示。按下式計算酶的相對活性△A470×酶提取液總量（ml）酶活性（△A470·g－1Fw·min－1）=———————————————————樣品鮮重（g）×測定時酶液用量（ml）過氧化氫酶的活性測定——紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波長下有強烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度(A240)隨反應(yīng)時間而降低。根據(jù)測量吸光率的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性?！緝x器與用具】紫外分光光度計；離心機；研缽；250ml容量瓶

6、1個；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml試管3支；恒溫水?。弧驹噭?.2mol/LpH7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/LH2O2（用0.1mol/L高錳酸鉀標(biāo)定）。【方法】1.酶液提?。悍Q取新鮮小麥葉片或其它植物組織0.5g置研缽中，加入2～3ml4℃下預(yù)冷的pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽數(shù)次，合并沖洗液，并定容到刻度?；旌暇鶆?qū)⒘科恐?℃冰箱中靜置10min，取上部澄清液在4000rpm下離心15min，上清液即為過氧化氫酶粗提液。5℃下保存?zhèn)溆谩?.測定：取1

7、0ml試管3支，其中2支為樣品測定管，1支為空白管，按表40-2順序加入試劑。表40-2紫外吸收法測定H2O2樣品液配置表管號S1S2S3粗酶液(ml)0.20.20.2pH7.8磷酸(ml)1.51.51.5蒸餾水(ml)1.01.01.025℃預(yù)熱后,逐管加入0.3ml0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下測定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測4min，待3支管全部測定完后，按下式計算酶活性。3.結(jié)果計算：以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個酶活單位（u）。過氧化氫酶活性(u/gFW/min)=式中A240=

8、AS0－A